मेथिलीन ब्लू, Nrf2 और माइटोकॉन्ड्रियल जैवजनन: क्या मापा गया और क्या अभी प्रस्तावित है

मेथिलीन ब्लू के बारे में लिखते समय एक वाक्य अक्सर सामने आता है: यह Nrf2 को सक्रिय करता है और नए माइटोकॉन्ड्रिया बनाता है। यह वाक्य एक ही दावे जैसा लगता है, लेकिन इसमें दो अलग-अलग अवधारणाएँ हैं, जिनका अध्ययन अलग-अलग प्रणालियों में, अलग-अलग प्रकार के प्रमाणों के आधार पर किया गया है। पहली एक संकेतन मार्ग है, एक ऐसा संवेदक जो रक्षा संबंधी जीनों को सक्रिय करता है। दूसरी एक निर्माण कार्यक्रम है, जिसमें कोशिका अधिक माइटोकॉन्ड्रियल तंत्र बनाती है। कोई संकेत निर्माण शुरू कर सकता है, लेकिन संकेत सक्रिय हुआ यह दिखाना, निर्माण पूरा हुआ यह दिखाने के बराबर नहीं है। और अधिक निर्माण सामग्री दिखाना, बेहतर ऊर्जा आपूर्ति दिखाने के बराबर नहीं है। यह लेख इन तीनों बातों को अलग रखता है।

Nrf2 की अवधारणा: एक संवेदक, ढाल नहीं

Nrf2 (न्यूक्लियर फैक्टर एरिथ्रॉइड 2-रिलेटेड फैक्टर 2) एक प्रतिलेखन कारक है, यानी ऐसा प्रोटीन जिसका काम जीनों को सक्रिय करना है। सामान्य अवस्था में Keap1 नामक संवेदक प्रोटीन इसे कोशिकाद्रव्य में पकड़े रखता है और निरंतर विघटन के लिए कोशिका के निस्तारण तंत्र को सौंपता है। जब ऑक्सिडेंट या इलेक्ट्रोफाइल Keap1 पर मौजूद प्रतिक्रियाशील सिस्टीन अवशेषों को संशोधित करते हैं, तो यह निस्तारण रुक जाता है। नया बना Nrf2 जमा होता है, कोशिका के केंद्रक में जाता है, छोटे Maf प्रोटीनों के साथ जुड़ता है और एंटीऑक्सिडेंट रिस्पॉन्स एलिमेंट कहलाने वाले DNA अनुक्रमों से बंधता है। यह बंधन रक्षा संबंधी कई जीनों को सक्रिय कर देता है।

इस मार्ग के मानक माप-संकेत विशिष्ट हैं। NQO1 (NAD(P)H क्विनोन डिहाइड्रोजनेज़ 1) और TrxR1 (थायोरेडॉक्सिन रिडक्टेज़ 1) सबसे विश्वसनीय Nrf2 लक्ष्य जीनों में शामिल हैं। HO-1 (हीम ऑक्सीजनेज़-1) को प्रबल रूप से प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन यह अन्य नियामकों के प्रति भी प्रतिक्रिया करता है। SOD और कैटालेज़ जैसे एंजाइम एंटीऑक्सिडेंट तंत्र का हिस्सा हैं, लेकिन उनके स्तर कई प्रतिलेखन कारकों के नियंत्रण में होते हैं। इसलिए SOD में वृद्धि अपने आप यह साबित नहीं करती कि उसका कारण Nrf2 था। संकेतन घटना के सबसे निकट के प्रमाण हैं: केंद्रक में Nrf2 का संचय, किसी ARE रिपोर्टर का सक्रिय होना, या मानक लक्ष्य जीनों का ऐसा प्रेरण जो Nrf2 को हटाने पर गायब हो जाए। बाकी सब—ऑक्सिडेंट के कम स्तर, तनाव की स्थिति में बेहतर जीवित रहना, अधिक ग्लूटाथायोन—बाद के प्रभाव हैं, जिन्हें कई मार्ग उत्पन्न कर सकते हैं।

इस कहानी में मेथिलीन ब्लू से जुड़ा सबसे शुरुआती परिणाम इसी पैमाने पर संकेतन घटना के निकट आता है। nanomolar स्तर के मेथिलीन ब्लू के संपर्क में आए फाइब्रोब्लास्ट में कोशिकीय जीर्णावस्था देर से आई। साथ ही कॉम्प्लेक्स IV की मात्रा बढ़ी, ऑक्सीजन खपत बढ़ी और फेज़-2 एंजाइम TrxR1 तथा NQO1 का प्रेरण हुआ, जैसा कि मेथिलीन ब्लू को पहली बार माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता में वृद्धि और कोशिकीय जीर्णावस्था में विलंब से जोड़ने वाले अध्ययन में बताया गया है। TrxR1 और NQO1 ठीक वही मानक Nrf2 लक्ष्य हैं जिन्हें एक सावधान पाठक देखना चाहेगा। अध्ययन ने स्वयं संकेतन घटना नहीं दिखाई: न केंद्रक में Nrf2 का मापन, न ARE रिपोर्टर, न Nrf2 नॉकआउट नियंत्रण। इसलिए निष्पक्ष व्याख्या यह है कि इस प्रणाली में मेथिलीन ब्लू ज्ञात Nrf2 लक्ष्य जीनों को प्रेरित करता है। यह Nrf2 सक्रियण के अनुरूप है, लेकिन Nrf2 को कारण के रूप में अलग करके स्थापित नहीं करता। लक्ष्य जीन का प्रेरण उस स्विच के सक्रिय होने के बाद का एक चरण है।

जैवजनन की अवधारणा: तीन जाँच-बिंदुओं वाला कार्यक्रम

माइटोकॉन्ड्रियल जैवजनन वह कार्यक्रम है जिसके जरिए कोशिका अपनी माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता बढ़ाती है। पाठ्यपुस्तकों में इसका क्रम तीन जाँच-बिंदुओं से होकर गुजरता है। पहले, सह-सक्रियक PGC-1alpha इस कार्यक्रम को शुरू करता है। दूसरे, केंद्रकीय प्रतिलेखन कारक माइटोकॉन्ड्रियल जीनों की अभिव्यक्ति को बढ़ाते हैं। इनमें TFAM भी शामिल है, जो माइटोकॉन्ड्रियल DNA का रखरखाव और प्रतिकृति निर्माण करता है। भ्रम पैदा करने वाली बात यह है कि इन प्रतिलेखन कारकों में से एक का नाम NRF1, यानी न्यूक्लियर रेस्पिरेटरी फैक्टर 1 है, जो Nrf2 से अलग प्रोटीन है। तीसरे, कोशिका में अधिक माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम और अधिक श्वसन तंत्र बन जाते हैं। इन्हें mtDNA प्रतिलिपि संख्या, साइट्रेट सिंथेज़ गतिविधि, या श्वसन कॉम्प्लेक्स की मात्रा और गतिविधि के रूप में मापा जा सकता है।

हर जाँच-बिंदु पर किए जा सकने वाले दावे की मजबूती अलग होती है। अधिक PGC-1alpha या TFAM संदेशवाहक RNA यह दिखाता है कि कार्यक्रम शुरू करने का निर्देश मिला, यह नहीं कि वह पूरा हो गया। अधिक mtDNA या अधिक कॉम्प्लेक्स IV प्रोटीन अधिक सामग्री दिखाते हैं, लेकिन पुनर्गठित माइटोकॉन्ड्रिया भी ऐसा ही दिख सकते हैं। बेहतर श्वसन, अधिक ऑक्सीजन खपत या कॉम्प्लेक्स गतिविधि यह दिखाती है कि कार्य बदला, लेकिन बिना कोई नया माइटोकॉन्ड्रिया बने भी कार्य बेहतर हो सकता है। जैवजनन का मजबूत दावा तीनों को जोड़ता है: नियामक, सामग्री और कार्य।

फाइब्रोब्लास्ट पर किए गए अनुवर्ती अध्ययन ने इस शृंखला के अधिकांश चरणों की जाँच की। 100 nanomolar मेथिलीन ब्लू से उपचारित मानव IMR90 कोशिकाओं में NAD से NADH का अनुपात 15 मिनट के भीतर अस्थायी रूप से बढ़ा और एक दिन के भीतर शुरुआती स्तर पर लौट आया। इस अस्थायी ऊर्जा संकेत के बाद ऊर्जा संवेदक AMPK का अस्थायी फॉस्फोराइलेशन हुआ, फिर PGC-1alpha और SURF1 का प्रेरण हुआ। SURF1 एक ऐसा प्रोटीन है जो कार्यशील कॉम्प्लेक्स IV के संयोजन के लिए आवश्यक है। कॉम्प्लेक्स IV की गतिविधि लगभग दोगुनी हुई, कोशिकीय ऑक्सिडेंट लगभग 28 प्रतिशत घटे और टेलोमियर अधिक धीरे-धीरे क्षीण हुए। यह पूरा क्रम मेथिलीन ब्लू की रेडॉक्स गतिविधि को AMPK और माइटोकॉन्ड्रियल जैवजनन से जोड़ने वाले शोधपत्र में प्रस्तुत है।

उस शोधपत्र के दो विवरण ध्यान देने योग्य हैं, क्योंकि ऐसे विवरण अक्सर छूट जाते हैं। पहला, केवल सक्रियण की मौजूदगी से अधिक महत्वपूर्ण उसका स्वरूप था: मेथिलीन ब्लू ने AMPK को अस्थायी रूप से सक्रिय किया, जबकि तुलना के लिए इस्तेमाल की गई दवा AICAR ने उसे लंबे समय तक सक्रिय रखा। अस्थायी सक्रियक ने कोशिकीय जीर्णावस्था को लगभग आठ गुना अधिक प्रभावी ढंग से विलंबित किया। इसलिए “मेथिलीन ब्लू AMPK को सक्रिय करता है” जैसा दावा अधूरा है। महत्वपूर्ण दावा यह है कि वह AMPK को अस्थायी रूप से सक्रिय करता है, और यह तुलना संकेत देती है कि लंबे समय तक सक्रियण वही काम नहीं करता। दूसरा, मेथिलीन ब्लू ने कोशिका चक्र को नहीं बदला। इससे सबसे साधारण वैकल्पिक व्याख्या खारिज होती है कि कोशिकाएँ बस अधिक धीरे विभाजित हुईं और इसी वजह से कम उम्र की दिखीं।

चूहों में अध्ययन: व्यवहार, जीनोम और एक जानबूझकर विरोधाभासी उत्प्रेरक

कोशिका-संवर्धन के काम को मध्य आयु के चूहों का अध्ययन करने वाले एक समूह ने पशुओं तक बढ़ाया। 60 दिनों तक मुँह के रास्ते मेथिलीन ब्लू दिए जाने के बाद, उपचारित चूहों में अनुपचारित वृद्ध चूहों की तुलना में शारीरिक सहनशक्ति और खोजपरक व्यवहार अधिक बने रहे तथा चिंता जैसा व्यवहार कम दिखाई दिया। मस्तिष्क ऊतक में, उम्र बढ़ने के कारण दब गए जीनों—NRF1, TFAM, SOD2 और कॉम्प्लेक्स IV की उपइकाई COX1—की अभिव्यक्ति वयस्क स्तरों की ओर लौटी, और mtDNA प्रतिलिपि संख्या बढ़ी। ये परिणाम—व्यवहार, नियामक और जीनोम की मात्रा—मेथिलीन ब्लू और मस्तिष्क में माइटोकॉन्ड्रियल जैवजनन पर मध्य आयु के चूहों में किए गए अध्ययन में बताए गए हैं।

प्रस्तावित उत्प्रेरक दिलचस्प है, क्योंकि यह इस सरल धारणा के विपरीत जाता है कि मेथिलीन ब्लू एक एंटीऑक्सिडेंट है। उपचारित चूहों के मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, विशेष रूप से हाइड्रोजन पेरॉक्साइड, का उत्पादन अधिक दिखा। लेखकों का प्रस्ताव था: हल्का पेरॉक्साइड संकेत ही Nrf2 मार्ग को सक्रिय करता है, जो फिर जैवजनन कार्यक्रम को चलाता है। इस मॉडल में मेथिलीन ब्लू शुरुआत के चरण में प्रो-ऑक्सिडेंट और परिणाम के चरण में एंटीऑक्सिडेंट है। इस स्वरूप को औषधिविज्ञानी हॉरमेसिस कहते हैं, जिसमें हल्का तनाव अपने से बड़ी रक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है। पेरॉक्साइड में यह वृद्धि वास्तव में Nrf2 सक्रियण का कारण बनती है या नहीं, इसकी सीधे जाँच नहीं की गई। यह दोनों के बीच प्रस्तावित कड़ी है, मापा गया संबंध नहीं।

उसी समूह के एक संबद्ध अध्ययन ने इस प्रस्ताव के सुरक्षा पक्ष की कड़ी जाँच की। अलग किए गए मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया में मेथिलीन ब्लू ने 50 nanomolar जितनी कम सांद्रता पर भी हाइड्रोजन पेरॉक्साइड का उत्पादन बढ़ाया, फिर भी चिकित्सीय सांद्रताओं पर माइटोकॉन्ड्रियल DNA में कोई पता लगाने योग्य क्षति नहीं हुई। केवल 100 micromolar पर, जो चिकित्सीय स्तरों से बहुत ऊपर है, चुनिंदा mtDNA खंडों में क्षति दिखी। वहीं 20 micromolar रंग और लाल प्रकाश के संयोजन ने सिंगलेट ऑक्सीजन उत्पन्न की, जिसने व्यापक रूप से mtDNA को क्षति पहुँचाई। यह रंग का ज्ञात प्रकाश-संवेदीकारक व्यवहार है, न कि प्रकाश की अनुपस्थिति में उसकी औषधीय क्रिया। पूर्व-उपचार ने मध्य मस्तिष्क के अधर भाग के माइटोकॉन्ड्रिया को रोटेनोन से उत्पन्न mtDNA क्षति से भी बचाया। खुराक-प्रतिक्रिया और आनुवंशिक विषाक्तता के नियंत्रणों का विवरण मेथिलीन ब्लू द्वारा आनुवंशिक क्षति के बिना पेरॉक्साइड उत्पादन पर किए गए अध्ययन में दिया गया है।

मापा गया बनाम प्रस्तावित: आरेख को समझना

नीचे दिया गया मार्ग-आरेख इस लेख के लिए बनाया गया है, ताकि पाठ में किए जा रहे अंतर को स्पष्ट रखा जा सके। ठोस सीमाओं वाले बॉक्स उन चरणों को दिखाते हैं जिनके लिए मेथिलीन ब्लू से जुड़े शोध साहित्य में प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक समर्थन है: NAD/NADH को बदलने वाला रेडॉक्स चक्रण, अस्थायी AMPK फॉस्फोराइलेशन, PGC-1alpha और SURF1 का प्रेरण, कॉम्प्लेक्स IV की अधिक गतिविधि, NQO1 और TrxR1 का प्रेरण, चूहों के मस्तिष्क में जैवजनन जीनों की अभिव्यक्ति और mtDNA प्रतिलिपि संख्या की बहाली, तथा चिकित्सीय खुराकों पर mtDNA क्षति के बिना पेरॉक्साइड में वृद्धि। टूटी रेखाओं वाली सीमाओं के बॉक्स प्रस्तावित संबंध दिखाते हैं: Keap1 द्वारा पेरॉक्साइड संकेत को पहचानना, केंद्रक में Nrf2 का संचय रक्षा जीनों को सक्रिय करना, और Nrf2 सक्रियण से जैवजनन कार्यक्रम तक कारणात्मक तीर। टूटी रेखाओं वाले ये चरण संभाव्य हैं, आँकड़ों के अनुरूप हैं और मानक पाठ्यपुस्तकीय जीवविज्ञान का हिस्सा हैं। लेकिन इन शोधपत्रों में उन्हें ऐसे नियंत्रणों—केंद्रकीय Nrf2, ARE रिपोर्टर, Nrf2 नॉकआउट—के साथ नहीं मापा गया, जो उन्हें ठोस सीमाओं वाले बॉक्स में बदल सकें।

आरेख सामने होने पर तीन भ्रम स्पष्ट हो जाते हैं। पहला, NRF1 और Nrf2 लगभग एक जैसे नामों वाले अलग-अलग प्रोटीन हैं। चूहों वाले अध्ययन ने न्यूक्लियर रेस्पिरेटरी फैक्टर 1 को मापा था, जो जैवजनन का नियामक है, न कि एंटीऑक्सिडेंट प्रतिलेखन कारक को। दोनों को एक मान लेने से पूरा आरेख एक ही बिंदु में सिमट जाता है। दूसरा, जीन अभिव्यक्ति कहानी की शुरुआत है, अंत नहीं। TFAM या COX1 संदेशों की बहाली जैवजनन का निर्देश मिलने का समर्थन करती है, जबकि mtDNA प्रतिलिपि संख्या और कॉम्प्लेक्स IV गतिविधि इस बात के प्रमाण हैं कि वह निर्देश पूरा हुआ। तीसरा, एंटीऑक्सिडेंट परिणाम Nrf2 मार्ग को साबित नहीं करता। फाइब्रोब्लास्ट में ऑक्सिडेंट की 28 प्रतिशत गिरावट और चूहों में रोटेनोन से सुरक्षा वास्तविक बाद के प्रभाव हैं, लेकिन कई मार्ग इन परिणामों तक पहुँचते हैं।

टूटी रेखाओं वाले बॉक्स को ठोस बनाने के लिए क्या चाहिए

जिन प्रयोगों की कमी है, वे मानक प्रयोग हैं। मेथिलीन ब्लू के संपर्क के बाद केंद्रकीय Nrf2 प्रोटीन को ऐसे समयक्रम में मापना जो अस्थायी AMPK संकेत से मेल खाता हो, यह जाँचेगा कि क्या दोनों शाखाएँ वास्तव में साथ सक्रिय होती हैं, जैसा समकालिक सक्रियण की परिकल्पना दावा करती है। ARE-संचालित रिपोर्टर लक्ष्य जीनों से अनुमान लगाने के बजाय प्रतिलेखन गतिविधि की पुष्टि करेगा। Nrf2 को नॉकडाउन या नॉकआउट करके जैवजनन के माप दोहराना कारणात्मक तीर की सीधे जाँच करेगा: यदि Nrf2 के बिना भी कॉम्प्लेक्स IV का प्रेरण और mtDNA में वृद्धि बनी रहती है, तो यह कड़ी गलत है और केवल AMPK शाखा उस प्रभाव को उत्पन्न करती है। पशुओं में, उन्हीं तीन जाँच-बिंदुओं—नियामक, सामग्री, कार्य—के साथ लंबे समय तक खुराक देने का अध्ययन यह जाँचेगा कि कार्यक्रम चालू रहता है या अनुकूलित हो जाता है। तब तक ऊर्जा और रक्षा मार्गों का समकालिक सक्रियण वही है जो उसके लेखकों ने कहा था: एक संभावित महत्वपूर्ण कारक, स्थापित तंत्र नहीं।

व्यापक औषधिविज्ञान की पृष्ठभूमि से आने वाले पाठक संबंधित संदर्भ भी जानना चाह सकते हैं: मेथिलीन ब्लू माइटोकॉन्ड्रियल स्तर पर इलेक्ट्रॉनों को कैसे स्थानांतरित करता है, माइटोकॉन्ड्रिया और कोशिकीय ऊर्जा पर इसके अन्य क्या प्रभाव हैं, उम्र बढ़ने से जुड़े शोध में कोशिकीय जीर्णावस्था के निष्कर्ष कहाँ आते हैं, जैवजनन के दावों का संज्ञानात्मक प्रदर्शन से क्या संबंध है, और वह सुरक्षा रिकॉर्ड जो खुराक से जुड़ी हर चर्चा की सीमाएँ तय करता है। इनमें से हर विषय अपने प्रमाणों वाली एक अलग अवधारणा है, और हर एक को उसी तरह मापे गए बनाम प्रस्तावित के आधार पर परखा जाना चाहिए, जैसे इस लेख में Nrf2 को परखा गया है।