मेथिलीन ब्लू और नाइट्रिक ऑक्साइड: NOS, cGMP और रक्तवाहिका संकेतन

सवाल सरल लगता है: क्या मेथिलीन ब्लू नाइट्रिक ऑक्साइड को बाधित करता है? प्रयोगशाला में यह सवाल चार अलग-अलग सवालों में बँट जाता है, और प्रत्येक की प्रयोगात्मक जाँच अलग होती है। इन्हें आपस में मिला देना मुख्य कारण है कि मेथिलीन ब्लू और नाइट्रिक ऑक्साइड पर लिखा गया विवरण आत्मविश्वास से भरा, लेकिन अस्पष्ट लगता है।

नाइट्रिक ऑक्साइड संकेत को चार कड़ियों वाली एक शृंखला मानें। नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ बनाने के लिए एक जीन का प्रतिलेखन होता है। यह एंज़ाइम आर्जिनीन को नाइट्रिक ऑक्साइड में बदलता है। किसी अन्य पदार्थ से अभिक्रिया करने से पहले यह गैस विसरण द्वारा अपने लक्ष्य तक पहुँचती है। घुलनशील गुआनिलेट साइक्लेज़ इसे पहचानता है और चक्रीय GMP बनाता है। मेथिलीन ब्लू के हर कड़ी पर प्रभाव प्रकाशित किए गए हैं, लेकिन प्रमाण अलग-अलग प्रायोगिक प्रणालियों, अलग-अलग सांद्रताओं और अलग-अलग आइसोफ़ॉर्म से आते हैं। एक कड़ी का परिणाम दूसरी कड़ी पर क्रिया को साबित नहीं करता।

मानक शृंखला, सरल शब्दों में

रक्तवाहिका की दीवार में मानक क्रम इस प्रकार चलता है। कोई उद्दीपन एंडोथीलियल कोशिका पर काम करता है। एंडोथीलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़, जिसे eNOS या NOS3 कहते हैं, थोड़े समय के लिए नाइट्रिक ऑक्साइड की एक छोटी मात्रा बनाता है। यह गैस पास की चिकनी पेशी कोशिका में विसरण करती है, घुलनशील गुआनिलेट साइक्लेज़ के अपचयित लौह वाले हीम से जुड़ती है और GTP के चक्रीय GMP में रूपांतरण को तेज़ करती है। चक्रीय GMP प्रोटीन काइनेज़ G को सक्रिय करता है, कैल्शियम के प्रबंधन में बदलाव आता है और पेशी शिथिल हो जाती है।

एक दूसरी शृंखला भी है, जिसे अलग रखना ज़रूरी है। संक्रमण या साइटोकाइन के संपर्क के दौरान कोशिकाएँ एक अलग एंज़ाइम का प्रतिलेखन करती हैं: प्रेरणीय नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ या iNOS, जिसे NOS2 भी कहते हैं। यह eNOS की तुलना में नाइट्रिक ऑक्साइड का अधिक और लंबे समय तक चलने वाला प्रवाह पैदा करता है। तीसरा आइसोफ़ॉर्म, न्यूरोनल NOS या nNOS, एक और अलग संदर्भ से जुड़ा है। जब कोई शोधपत्र आइसोफ़ॉर्म बताए बिना नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ का उल्लेख करे, तो रुककर जाँचें कि किस आइसोफ़ॉर्म को मापा गया था। मेथिलीन ब्लू इलेक्ट्रॉनों को कैसे स्थानांतरित करता है, इसका अवलोकन सामान्य रूप से रेडॉक्स लक्ष्यों के बारे में भी यही बात बताता है: यह इलेक्ट्रॉन रिले अपने आप कुछ नहीं करता, और दोनों सिरों पर मौजूद साझेदार ही परिणाम तय करते हैं।

मापा गया चक्रीय GMP भी एक समेकित माप है, सीधे एंज़ाइम की जाँच नहीं। इसका स्तर साइक्लेज़ द्वारा संश्लेषण में से फॉस्फोडाइएस्टरेज़ द्वारा विघटन घटाने पर मिलने वाली मात्रा को दर्शाता है; रक्तवाहिकाओं की चिकनी पेशी में विशेष रूप से PDE5 महत्वपूर्ण है। इसलिए चक्रीय GMP में गिरावट का मतलब है कि संकेत पहचानने वाले घटक तक कम संकेत पहुँचा। यह अपने आप नहीं बताती कि कौन-सी कड़ी विफल हुई।

कड़ी 1: कम iNOS एंज़ाइम बनता है

बैक्टीरियल लिपोपॉलीसैकराइड, इंटरफेरॉन गामा या दोनों से उद्दीप्त चूहों की मैक्रोफेज़ कोशिकाओं में मेथिलीन ब्लू ने iNOS प्रोटीन की अपेक्षित वृद्धि रोकी और मैक्रोफेज़ प्रतिलेखन प्रयोगों में iNOS संदेशवाहक RNA को बहुत कम कर दिया। महत्वपूर्ण बात यह है कि किन चीज़ों में बदलाव नहीं आया। अवरोधक I कप्पा B अल्फा का विघटन, NF कप्पा B और STAT1 का फॉस्फोरिलीकरण तथा इन कारकों का केंद्रक में जाना काफी हद तक बरकरार रहा। जो घटा, वह था उनका DNA से बंधन। क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन ने iNOS प्रमोटर पर उनकी कम उपस्थिति दिखाकर इसकी पुष्टि की।

यह एंज़ाइम की मात्रा तय होने से पहले के चरण में जीन नियमन पर प्रभाव है, पहले से मौजूद एंज़ाइम का तात्कालिक अवरोध नहीं। यह सूजन-संबंधी संकेतन का हिस्सा है, जहाँ प्रोटीन बनने से पहले प्रतिलेखन कारकों को प्रमोटर से जुड़ना पड़ता है। यह आराम की अवस्था वाली रक्तवाहिका में मूलतः मौजूद eNOS के बारे में सीधे कुछ नहीं बताता, और इसका वर्णन इसी सीमा में किया जाना चाहिए।

कड़ी 2: पहले से मौजूद NOS एंज़ाइम धीमा काम करता है

चूहों पर हुए एक अध्ययन ने अलग स्तर की जाँच की। सचेत नर चूहों को शिरा के माध्यम से लिपोपॉलीसैकराइड दिया गया, फिर तीन घंटे बाद उन्हें शिरा के माध्यम से या तो सलाइन या 3 mg per kg मेथिलीन ब्लू दिया गया। हाइपोथैलेमस में NOS गतिविधि के अध्ययन में चिह्नित आर्जिनीन के सिट्रुलीन में रूपांतरण के आधार पर हाइपोथैलेमस के मध्य आधार भाग में नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ की गतिविधि मापी गई। केवल तनाव और सलाइन ने कुछ कैल्शियम-स्वतंत्र गतिविधि प्रेरित की, और लिपोपॉलीसैकराइड ने इसे नियंत्रण स्तर के लगभग दस गुने तक बढ़ा दिया। मेथिलीन ब्लू ने दोनों प्रेरित घटकों को समाप्त कर दिया। उस ऊतक में, उस खुराक और उस समय-बिंदु पर कैल्शियम-निर्भर, मूलतः मौजूद गतिविधि में बदलाव नहीं हुआ।

उस परिणाम को ठीक उसी अर्थ में पढ़ें जिसमें वह लिखा गया है: उन परिस्थितियों में मापी गई iNOS-प्रकार की गतिविधि दब गई। यह जीन अभिव्यक्ति का माप नहीं है, और यह eNOS या nNOS के बजाय iNOS के प्रति स्थायी चयनात्मकता का प्रमाण भी नहीं है। शुद्ध एंज़ाइमों पर किए गए प्रयोग इस सावधानी को और स्पष्ट करते हैं। शुद्ध नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ की प्रत्यक्ष जाँच में मेथिलीन ब्लू ने 30 micromolar पर सिट्रुलीन का निर्माण पूरी तरह रोक दिया। आधे अवरोध के लिए आवश्यक सांद्रता सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज़ के बिना लगभग 5.3 micromolar और इसके साथ 9.2 micromolar थी, जैसा कि शुद्ध NOS और गुआनिलेट साइक्लेज़ की तुलना में बताया गया है। शुद्ध nNOS पर हुए एक अलग अध्ययन ने एंज़ाइम से जुड़े हीम के ऑक्सीकरण की भूमिका का संकेत दिया। व्यावहारिक सीख यह है कि पृथक प्रणालियों में NOS का प्रत्यक्ष अवरोध वास्तव में होता है, लेकिन हाइपोथैलेमस के परिणाम को खींचकर यह सामान्य दावा नहीं किया जा सकता कि मेथिलीन ब्लू हर जगह मूलतः मौजूद सभी NOS को अप्रभावित छोड़ देता है।

कड़ी 3: पहुँचने से पहले नाइट्रिक ऑक्साइड नष्ट हो जाता है

चक्रीय GMP में गिरावट को एंज़ाइम अवरोध के अलावा किसी अन्य प्रक्रिया से समझाया जा सकता है—इसका सबसे स्पष्ट प्रदर्शन संवर्धित खरगोश की फुफ्फुसीय धमनी की चिकनी पेशी कोशिकाओं से मिलता है। प्रयोग की रूपरेखा ने सीधे नाइट्रिक ऑक्साइड दाता जोड़कर अंतर्जात NOS को पूरी तरह दरकिनार किया। फिर रक्तवाहिका की चिकनी पेशी में सुपरऑक्साइड के अध्ययन में जाँचा गया कि क्या मेथिलीन ब्लू तब भी चक्रीय GMP की प्रतिक्रिया को दबाता है।

तीन दाताओं को 1 से 100 micromolar तक जाँचा गया: S नाइट्रोसो L सिस्टीन, सोडियम नाइट्रोप्रुसाइड और MPANO नामक एक स्थिर डीअमिनीकृत अनुरूप। सभी ने चक्रीय GMP को लगभग 1.5 गुने से 12 गुने तक बढ़ाया। 10 micromolar मेथिलीन ब्लू ने पहले दो की प्रतिक्रिया को 51 से 100 प्रतिशत तक बाधित किया और MPANO की प्रतिक्रिया को अपरिवर्तित छोड़ा। यदि मेथिलीन ब्लू केवल साइक्लेज़ के उत्प्रेरक स्थल को अवरुद्ध कर रहा होता, तो दाताओं के प्रति यह चयनात्मकता समझाना कठिन होता, क्योंकि तीनों आगे उसी एंज़ाइम पर जाकर काम करते हैं।

इसके बाद तीन नियंत्रणों ने इस तंत्र को सुपरऑक्साइड से जोड़ा। पहला, ज़ैंथीन और ज़ैंथीन ऑक्सिडेज़ से कोशिका के बाहर सुपरऑक्साइड उत्पन्न करने पर वही पैटर्न मिला: CYSNO और नाइट्रोप्रुसाइड की प्रतिक्रिया अवरुद्ध हुई, MPANO की नहीं। दूसरा, मेथिलीन ब्लू ने चिकनी पेशी कोशिकाओं से खुराक और समय पर निर्भर सुपरऑक्साइड उत्पादन कराया, जिसे साइटोक्रोम c के अपचयन से मापा गया। तीसरा, सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज़ ने अवरोध को पूरी तरह रोका, जबकि कैटालेज़ ने नहीं। इससे उस प्रायोगिक प्रणाली में निकटतम कारण के रूप में हाइड्रोजन पेरॉक्साइड के बजाय सुपरऑक्साइड की ओर संकेत मिलता है।

प्रयोग के सह-संवर्धन वाले रूप का उल्लेख करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह बताता है कि प्रभाव कहाँ होता है। कवरस्लिप पर मौजूद एंडोथीलियल कोशिकाओं को कुछ समय के लिए चिकनी पेशी कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित किया गया। इससे आधारभूत अवस्था में छोड़े गए एंडोथीलियल कारक ने चिकनी पेशी में चक्रीय GMP को तीन से आठ गुना बढ़ा दिया। किसी भी कोशिका-समूह को पहले मेथिलीन ब्लू के संपर्क में रखने से यह संकेत कम हुआ, और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज़ ने एंडोथीलियल कोशिकाओं के पूर्व-उपचार के प्रभाव को आंशिक रूप से पलट दिया। दूसरे शब्दों में, मेथिलीन ब्लू को चिकनी पेशी की संकेत पहचानने वाली कोशिका के भीतर काम करना आवश्यक नहीं है। वह रास्ते में संदेशवाहक को हटाकर संकेत कम कर सकता है। मेथिलीन ब्लू अनुसंधान पढ़ने की मार्गदर्शिका इसे एक सामान्य नियम मानती है: किसी आणविक लक्ष्य का नाम बताने से पहले बताएँ कि हस्तक्षेप किस हिस्से में हुआ।

इसे NOS अवरोध कहना गलत होगा। दाताओं के काम करने के लिए सिंथेज़ का कोई चरण आवश्यक नहीं था, फिर भी संकेत घट गया।

कड़ी 4: संकेत पहचानने वाला घटक स्वयं कम प्रतिक्रिया देता है

घुलनशील गुआनिलेट साइक्लेज़ पर प्रत्यक्ष प्रभाव होते हैं, लेकिन सांद्रताएँ महत्वपूर्ण हैं। ऊपर उद्धृत शुद्ध एंज़ाइमों की तुलना में, नाइट्रिक ऑक्साइड से उद्दीप्त साइक्लेज़ के आधे अवरोध के लिए लगभग 60 micromolar मेथिलीन ब्लू आवश्यक था। इसके मुकाबले NOS के आधे अवरोध के लिए लगभग 5 से 9 micromolar आवश्यक था, और 1 millimolar ने भी अधिकतम अवरोध को केवल आंशिक स्तर तक पहुँचाया। यह लगभग छह से ग्यारह गुने का अंतर है। इसलिए कम micromolar सांद्रता पर हुए किसी कोशिका प्रयोग में चक्रीय GMP घटने को, केवल उसके माप के आधार पर, साइक्लेज़ का चयनात्मक अवरोध नहीं कहा जा सकता।

बाद के एक रेडॉक्स अध्ययन ने दूसरी सावधानी जोड़ी: मेथिलीन ब्लू ने नाइट्रिक ऑक्साइड से सक्रिय साइक्लेज़ को ऐसे तंत्र से निष्क्रिय किया जो हीम के लौह के हवा से होने वाले साधारण ऑक्सीकरण से अलग था। यानी संकेत पहचानने वाला घटक प्रभावित हो सकता है, लेकिन इसका रसायन अभी पूरी तरह स्पष्ट नहीं है। सांद्रताओं का अंतर भी बताता है कि कम micromolar संपर्क पर पहले सुपरऑक्साइड और NOS के प्रभावों की संभावना को खारिज करना चाहिए। फॉस्फोडाइएस्टरेज़ का नियंत्रण भी इसी संदर्भ में आता है। जब तक विघटन को मापा या अवरुद्ध न किया गया हो, चक्रीय GMP का कम संचय कम संश्लेषण, तेज़ विघटन या दोनों के अनुरूप हो सकता है।

इसे रक्तचाप से जुड़े एक दावे में क्यों नहीं समेटा जा सकता

हर कड़ी एक अलग प्रणाली में स्थापित की गई थी। मैक्रोफेज़ का प्रतिलेखन हाइपोथैलेमस की एंज़ाइम गतिविधि नहीं है। लिपोपॉलीसैकराइड के बाद हाइपोथैलेमस की गतिविधि, आराम की अवस्था का एंडोथीलियल टोन नहीं है। सह-संवर्धन में आधारभूत अवस्था में छोड़ा गया एंडोथीलियल कारक, एगोनिस्ट से उद्दीप्त रक्तवाहिका-विस्तार नहीं है। 10 micromolar मेथिलीन ब्लू के संपर्क में संवर्धित फुफ्फुसीय धमनी की कोशिकाएँ, मानव रक्तसंचार नहीं हैं। इन सबको “मेथिलीन ब्लू नाइट्रिक ऑक्साइड को अवरुद्ध करके रक्तचाप बढ़ाता है” जैसे कथन में समेट देना ठीक उन्हीं भेदों को मिटा देता है जिन्हें सुरक्षित रखने के लिए नियंत्रण बनाए गए थे।

तीन जाँचें इस विवरण को प्रमाणों के अनुरूप रखती हैं। पहली, आइसोफ़ॉर्म का नाम बताएँ: आराम की अवस्था के रक्तवाहिका टोन के लिए eNOS, प्रेरित सूजन-संबंधी प्रवाह के लिए iNOS, तथा न्यूरोनल और कुछ शुद्ध एंज़ाइम संदर्भों के लिए nNOS। दूसरी, बताएँ कि नाइट्रिक ऑक्साइड संकेत कैसे पहुँचा: अंतर्जात संश्लेषण, आधारभूत एंडोथीलियल स्राव या CYSNO, नाइट्रोप्रुसाइड अथवा MPANO जैसा कोई विशिष्ट दाता। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि स्थिर दाता ने मेथिलीन ब्लू के प्रभाव का प्रतिरोध किया, जबकि अस्थिर दाताओं ने नहीं। तीसरी, सांद्रता और प्रभाव को पलटने वाले नियंत्रण का नाम बताएँ: सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज़ द्वारा प्रभाव का निवारण सुपरऑक्साइड की भूमिका दर्शाता है; कैटालेज़ की विफलता उस प्रायोगिक प्रणाली में हाइड्रोजन पेरॉक्साइड की भूमिका के विरुद्ध जाती है; ज़ैंथीन ऑक्सिडेज़ द्वारा उसी प्रभाव की नकल दिखाती है कि वह प्रक्रिया प्रभाव उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है; और शुद्ध एंज़ाइमों की जाँच सीधे उत्प्रेरण पर प्रभावों को रास्ते में होने वाली हानि से अलग करती है।

संक्षिप्त निष्कर्ष यह है। मेथिलीन ब्लू को चयनात्मक साइक्लेज़ अवरोधक मानने के बजाय, नाइट्रिक ऑक्साइड से चक्रीय GMP तक के संकेतन में कई स्थलों पर व्यवधान डालने वाला पदार्थ मानना अधिक उचित है। प्रायोगिक प्रणाली और सांद्रता के अनुसार, यह iNOS प्रतिलेखन कारकों का बंधन कम कर सकता है, सीधे NOS एंज़ाइमों को बाधित कर सकता है, सुपरऑक्साइड उत्पन्न करके नाइट्रिक ऑक्साइड की उपलब्धता घटा सकता है और नाइट्रिक ऑक्साइड से सक्रिय साइक्लेज़ की कार्यक्षमता कम कर सकता है। रक्तवाहिका अध्ययनों में चक्रीय GMP संकेतन की भूमिका और कोशिका परीक्षणों में इस्तेमाल किए गए नाइट्रिक ऑक्साइड दाताओं की तुलना इनमें से एक-एक शाखा को अधिक विस्तार से समझाते हैं। वहीं, रेडॉक्स प्रभावों को एंज़ाइम प्रभावों से अलग करने की विधियाँ बताती हैं कि इस साहित्य में सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज़, कैटालेज़ और स्थिर दाता वाला नियंत्रण एक साथ इतनी बार क्यों दिखाई देते हैं।

मेथिलीन ब्लू के बाद चक्रीय GMP का कम मान बताता है कि शृंखला टूटी है। केवल नियंत्रण ही बताते हैं कि कौन-सी कड़ी टूटी।