मिथिलीन ब्लू के माइटोकॉन्ड्रियल प्रभावों का मापन: ऑक्सीजन, ATP और झिल्ली विभव

मान लें कि कोई प्रयोगशाला श्वसन-बाधित माइटोकॉन्ड्रिया में मिथिलीन ब्लू मिलाती है और ऑक्सीजन उपभोग बढ़ता देखती है। सहज रूप से यह लिखा जा सकता है कि रंजक ने माइटोकॉन्ड्रियल कार्य बहाल कर दिया। यह कथन गलत हो सकता है। ऑक्सीजन प्रवाह, ATP संश्लेषण और झिल्ली विभव तीन अलग-अलग अवधारणाएँ हैं। वे एक ही कोशिकांग से उसी तरह जुड़े हैं जैसे बैकअप, सिंक और साझा करना एक ही क्लाउड फ़ोल्डर से जुड़े होते हैं: संबंधित, लेकिन अलग-अलग नियमों से संचालित। एक को दूसरा समझ लेने पर व्याख्या गलत हो जाती है, भले ही हर मापन तकनीकी रूप से सही हो।

मिथिलीन ब्लू के साथ यह भ्रम होने की संभावना अधिक है, क्योंकि वह जिस तंत्र को मापता है, उसमें स्वयं भाग लेता है। वह रेडॉक्स चक्र में भाग लेने वाला पदार्थ है, जो मार्ग के पहले चरणों में इलेक्ट्रॉन स्वीकार करता है और बाद के चरणों में उन्हें देता है; वह एक लिपोफिलिक धनायन है, जो ऊर्जित माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होता है; और वह गहरे नीले रंग का यौगिक है, जो सामान्य प्रोब के समान वर्णक्रमीय बैंड में प्रकाश अवशोषित और उत्सर्जित करता है। अकेला माप इन सभी पहलुओं को नहीं संभाल सकता। बुडापेस्ट के माइटोकॉन्ड्रियल अध्ययनों में दिखाया गया विश्वसनीय तरीका है: ऑक्सीजन प्रवाह के साथ ATP संश्लेषण दर, झिल्ली विभव और हाइड्रोजन पेरॉक्साइड विमोचन मापना, और हर चरण में रंजक-विशिष्ट नियंत्रण रखना।

रेस्पिरोमेट्री ऑक्सीजन प्रवाह मापती है, ऊर्जा उत्पादन नहीं

उच्च-विभेदन रेस्पिरोमेट्री, चाहे Oroboros Oxygraph से की जाए या Seahorse बाह्यकोशिकीय प्रवाह विश्लेषक से, एक ही बात बताती है: ऑक्सीजन का अपचयन कितनी तेजी से हो रहा है। वह यह नहीं बताती कि प्रति इलेक्ट्रॉन कितने प्रोटॉन पंप किए गए, कितना प्रवणता-आधारित ऊर्जा संरक्षण हुआ, या ATP सिंथेज़ ने उसका उपयोग किया या नहीं।

शब्दावली महत्वपूर्ण है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में ADP के बिना सब्सट्रेट देने से लीक श्वसन, संतृप्तिकारी ADP के साथ सब्सट्रेट देने से ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन क्षमता, और अनकपलर अनुमापन से अधिकतम इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण क्षमता मापी जाती है। अक्षुण्ण कोशिकाओं में इनके Seahorse समतुल्य हैं: आधारभूत श्वसन, ऑलिगोमाइसिन-संवेदनशील ATP-संबद्ध श्वसन, प्रोटॉन लीक, FCCP द्वारा निर्धारित अधिकतम श्वसन, और रोटेनोन व एंटीमाइसिन के प्रति प्रतिरोधी गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन उपभोग। Seahorse के परिणामों को स्टेट 3 और स्टेट 4 कहना ऐसी सटीकता का आभास देता है, जिसका यह नमूना-प्रणाली समर्थन नहीं करती, जैसा कि Agilent Mito Stress Test की रूपरेखा स्पष्ट करती है।

मिथिलीन ब्लू अधिक ऑक्सीजन और अधिक ऊर्जा के बीच के सहज संबंध को तोड़ देता है। पृथक मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया के अध्ययन के अनुसार, गिनी पिग के मस्तिष्क से पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में 100 nM से 1 uM रंजक ने ग्लूटामेट के साथ मैलेट, सक्सिनेट और अल्फा-ग्लिसरोफॉस्फेट सब्सट्रेटों पर विश्राम-अवस्था का ऑक्सीजन उपभोग बढ़ाया। अल्फा-ग्लिसरोफॉस्फेट पर वृद्धि लगभग 64 प्रतिशत थी, फिर भी स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया में ADP-प्रेरित श्वसन मूलतः अपरिवर्तित रहा। चूँकि लीक बढ़ा, जबकि ADP-प्रेरित प्रवाह स्थिर रहा, इसलिए गणना किया गया श्वसन नियंत्रण अनुपात घटता है। इस गिरावट का अर्थ यह नहीं है कि रंजक ने माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान पहुँचाया। इसका अर्थ है कि रंजक ने सामान्य श्वसन के अतिरिक्त एक ऑक्सीजन-उपभोगी रेडॉक्स चक्र जोड़ दिया। मिथिलीन ब्लू का ऐसा ऑक्सीजन उपभोग परीक्षण, जो केवल इस वृद्धि की रिपोर्ट करता है, वास्तविक रासायनिक गतिविधि तो मापता है, लेकिन ऊर्जा संरक्षण के बारे में कुछ नहीं बताता।

कार्यबहाली के प्रयोग यही अंतर बड़े पैमाने पर दिखाते हैं। कॉम्प्लेक्स I अवरुद्ध होने पर ऑक्सीजन प्रवाह लगभग तीन गुना बहाल हुआ, जबकि ATP संश्लेषण केवल लगभग 1.5 गुना बहाल हुआ। अधिक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड तक पहुँची। उसके अपेक्षाकृत कम हिस्से से ATP बना। बेहतर ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के किसी भी दावे के लिए ATP का पक्ष भी मापना आवश्यक है; आदर्श रूप से इसे प्रति ऑक्सीजन ATP के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाना चाहिए और हर की परिभाषा स्पष्ट करनी चाहिए।

ATP परीक्षण संश्लेषण दर मापते हैं, जिसकी जगह कुल मात्रा नहीं ले सकती

ATP परीक्षण एक अलग प्रश्न का उत्तर देता है: प्रति इकाई समय कितना ATP बनता है। समय के साथ लिया गया माप, चाहे वह कई मिनटों तक दर्ज की गई जुगनू लूसिफरेज़ की प्रकाशदीप्ति हो या 340 nm पर पढ़ा गया संयुक्त हेक्सोकाइनेज़ और ग्लूकोज़-6-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज़ परीक्षण, एक दर देता है। एक ही अंतिम समय-बिंदु पर कुल ATP का मापन उसकी मात्रा देता है। यह मात्रा संश्लेषण में से उपभोग घटाने के बाद का परिणाम दर्शाती है और अकेले ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के बारे में बहुत कम बताती है।

बुडापेस्ट समूह ने एडेनाइलेट काइनेज़ को दबाकर संयुक्त एंज़ाइमी विधि का उपयोग किया और पाया कि 1 से 2 uM मिथिलीन ब्लू ने रोटेनोन-उपचारित और एंटीमाइसिन-उपचारित माइटोकॉन्ड्रिया में ATP उत्पादन को थोड़ा, लेकिन सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण स्तर तक बढ़ाया। यह वास्तविक कार्यबहाली है, और यह आंशिक है। TEGDMA विषाक्तता अध्ययन को एक अलग मॉडल में इसी प्रकार का परिणाम मिला: 5 mM दंत मोनोमर TEGDMA ने कॉम्प्लेक्स I से जुड़े श्वसन को लगभग 286 से घटाकर 28 प्रवाह इकाइयों पर ला दिया, और 2 uM रंजक ने इसे लगभग 86 तक बहाल किया।

रंगीन रेडॉक्स यौगिक के साथ दो नियंत्रण अनिवार्य हैं। पहले, ऑलिगोमाइसिन का उपयोग करके निर्धारित करें कि मापे गए ATP संश्लेषण का कितना हिस्सा ATP सिंथेज़ पर निर्भर है। दूसरे, ज्ञात ATP, पूर्ण अभिकर्मक मिश्रण और उपयोग की गई रंजक की ठीक वही सांद्रताएँ मिलाकर कोशिका-रहित स्पाइक रिकवरी परीक्षण करें; कम-से-कम 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM और 2 uM पर। रंजक उत्सर्जित प्रकाश को अवशोषित कर सकता है, रिपोर्टर एंज़ाइम को बाधित कर सकता है या अभिकर्मक की रेडॉक्स रसायनिकी बदल सकता है। सामान्य लूसिफरेज़ परीक्षण मार्गदर्शन इसी प्रकार के हस्तक्षेप के लिए जैवरासायनिक प्रतिपरीक्षणों की अनुशंसा करता है। केवल इसलिए यह न मानें कि 1 uM पर मापन-विकृति नहीं होगी क्योंकि अधिक सांद्रताओं पर प्रकाश शमन आम तौर पर अधिक होता है।

झिल्ली-विभव प्रोब रंजक का वितरण मापते हैं, प्रवाह नहीं

सैफ्रेनिन O, TMRM और TMRE, रोडामीन 123 और JC-1 सभी झिल्ली-पारगम्य धनायन हैं। वे विद्युतरासायनिक संतुलन के अनुसार ऋणावेशित मैट्रिक्स में जमा होते हैं, इसलिए समग्र प्रतिदीप्ति प्रोब के स्थान के माध्यम से अप्रत्यक्ष रूप से विभव दर्शाती है। इनमें से कोई भी ATP या इलेक्ट्रॉन प्रवाह नहीं मापता।

हर प्रोब के लिए एक अधिक उपयुक्त नमूना-प्रणाली होती है। सैफ्रेनिन O पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और पारगम्य बनाई गई कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है। इसका उपयोग आम तौर पर लगभग 2 uM पर, लगभग 495 nm उत्तेजन और लगभग 585 nm उत्सर्जन के साथ, शमन अवस्था में किया जाता है, जहाँ प्रोब का अंदर जाना समग्र प्रतिदीप्ति बदलता है। TMRM और TMRE अक्षुण्ण कोशिकाओं में निम्न नैनोमोलर लोडिंग पर गैर-शमन अवस्था में उपयुक्त हैं। इसमें विध्रुवण होने पर रंजक बाहर निकलता है और माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिदीप्ति घटती है; अधिक लोडिंग पर स्व-शमन के कारण संकेत की दिशा उलट सकती है। JC-1 एक सुविधाजनक हरा-से-लाल अनुपात देता है, लेकिन वह लोडिंग और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान पर निर्भर करता है। इसलिए मात्रात्मक कार्य के लिए वह सावधानी से नियंत्रित TMRM की तुलना में कम उपयुक्त है। इन लाभों और सीमाओं का सार व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली-विभव प्रोब की समीक्षा में दिया गया है।

मिथिलीन ब्लू ठीक उन्हीं सांद्रताओं पर प्रकाशीय हस्तक्षेप करता है, जिन पर परीक्षण किए जाते हैं। लगभग 600 से 665 nm के उसके अवशोषण बैंड लाल प्रोब के उत्सर्जन से ओवरलैप करते हैं, इसलिए आंतरिक-फ़िल्टर प्रभाव, शमन और उत्तेजन प्रकाश का अवशोषण सभी संभावित हैं। रंजक स्वयं भी एक दूसरा लिपोफिलिक धनायन है, जिसका वितरण मापे जा रहे विभव के साथ बदलता है। इससे बचाव के लिए एक से अधिक स्वतंत्र माप और ब्लैंक आवश्यक हैं: केवल प्रोब, केवल रंजक, रंजक की प्रत्येक सांद्रता के साथ प्रोब, शून्य संदर्भ के रूप में FCCP से पूर्ण विध्रुवण, और आदर्श रूप से दूसरा प्रकाशीय रूप से भिन्न प्रोब। कॉम्प्लेक्स III बाइपास अध्ययन ने एंटीमाइसिन और माइक्सोथायज़ोल अवरोध के बाद सैफ्रेनिन O तथा TMRM दोनों से झिल्ली विभव की कार्यबहाली दोहराकर और एक जैसी गुणात्मक बहाली प्राप्त करके इसका उदाहरण प्रस्तुत किया। एक प्रकाशीय रिपोर्टर संकेत देता है। दो स्वतंत्र रिपोर्टर साक्ष्य देते हैं।

तीन नमूना-प्रणालियाँ, तीन अलग प्रश्न

पृथक माइटोकॉन्ड्रिया, पारगम्य बनाई गई कोशिकाएँ और अक्षुण्ण कोशिकाएँ एक ही परीक्षण की आपस में बदली जा सकने वाली संवेदनशीलता सेटिंग नहीं हैं। वे अलग-अलग अवधारणाएँ हैं, जिनके संचालन सिद्धांत अलग हैं।

पृथक माइटोकॉन्ड्रिया इलेक्ट्रॉन परिवहन शृंखला, आंतरिक झिल्ली और मैट्रिक्स की कार्यप्रणाली को बनाए रखते हैं, जबकि प्लाज़्मा झिल्ली, साइटोसोल और नेटवर्क संरचना को हटा देते हैं। यही हटाना इस प्रणाली का उद्देश्य है: सब्सट्रेट, ADP, अवरोधक और रंजक की सांद्रताएँ ठीक-ठीक निर्धारित होती हैं, इसलिए किसी मार्ग की पहचान की जा सकती है। इसकी कीमत स्वाभाविक सब्सट्रेट आपूर्ति, संकेत-संचार और मांग का खो जाना है।

पारगम्य बनाई गई कोशिकाएँ माइटोकॉन्ड्रिया को उनकी अधिकांश कोशिकीय संरचना के भीतर बनाए रखती हैं, जबकि बाहरी सब्सट्रेट और ADP को खुली हुई प्लाज़्मा झिल्ली से भीतर जाने देती हैं। कोशिकीय संदर्भ में किसी सब्सट्रेट-मार्ग की खराबी पहचानने के लिए वे सही साधन हैं। अत्यधिक पारगम्यता बाहरी झिल्ली को नुकसान पहुँचाती है, और साइटोसोल का नियमन धुलकर निकल जाता है।

अक्षुण्ण कोशिकाएँ सब कुछ बनाए रखती हैं: प्लाज़्मा झिल्ली का अवरोध, साइटोसोल के अपचायक, अंतर्जात सब्सट्रेट परिवहन, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क और ATP की मांग। वे शरीरक्रिया के सबसे निकट और क्रियाविधि को अलग करके समझने से सबसे दूर होती हैं, क्योंकि रंजक का ग्रहण, अपचयन और अलग-अलग स्थानों में संचित होना—सभी माइटोकॉन्ड्रिया तक वास्तव में पहुँचने वाली उसकी मात्रा को प्रभावित करते हैं।

TEGDMA अध्ययन ने जानबूझकर तीनों स्तरों का उपयोग किया: ऑक्सीकरण और विभव की रंजक-आधारित कार्यबहाली के लिए पृथक मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया; मुख्यतः खराबी को कॉम्प्लेक्स I से जुड़े सब्सट्रेट ऑक्सीकरण तक सीमित करने के लिए पारगम्य बनाई गई दंत पल्प स्टेम कोशिकाएँ; और दबे हुए ऑक्सीजन उपभोग पर 2 uM रंजक के समग्र शरीरक्रियात्मक प्रभाव के लिए अक्षुण्ण स्टेम कोशिकाएँ। अलग-अलग नमूना-प्रणालियों में माइटोकॉन्ड्रियल मापों की तुलना करने वाले पाठकों के लिए, मिथिलीन ब्लू श्वसन शृंखला में इलेक्ट्रॉनों को कैसे आगे बढ़ाता है, इस पर साथ का व्याख्यात्मक लेख मार्ग की पृष्ठभूमि देता है। मिथिलीन ब्लू के श्वसन अध्ययनों को पढ़ने की मार्गदर्शिका सांद्रता और अवरोधकों से जुड़े तर्क समझाती है।

रेडॉक्स-सक्रिय रंजक के लिए आवश्यक नियंत्रण

रेडॉक्स चक्र में भाग लेने वाले पदार्थ के लिए सामान्य अवरोधक की तुलना में नियंत्रणों की लंबी सूची चाहिए, क्योंकि अकेले रंजक की रासायनिक गतिविधि जैविक गतिविधि जैसी दिख सकती है।

रेस्पिरोमेट्री के लिए, मापन के बहाव की जाँच हेतु केवल बफ़र वाला कक्ष चलाएँ; जैविक सामग्री के बिना बफ़र और रंजक वाला कक्ष चलाएँ; परीक्षण में मौजूद किसी भी बाह्यकोशिकीय अपचायक के साथ रंजक की जाँच करें; और अक्षुण्ण कोशिकाओं में गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन उपभोग निर्धारित करने के लिए अंत में रोटेनोन और एंटीमाइसिन डालें। ध्यान दें कि अपचयित रंजक ऑक्सीजन को इलेक्ट्रॉन देकर दोबारा ऑक्सीकृत होता है और हाइड्रोजन पेरॉक्साइड बनाता है। इसलिए इलेक्ट्रॉन दाता के बिना केवल रंजक वाला ब्लैंक, NADH या NADPH उपलब्ध होने पर होने वाले कोशिका-रहित ऑक्सीजन उपभोग को कम आँकता है।

हाइड्रोजन पेरॉक्साइड के लिए गैर-चयनात्मक DCFDA रंजकों के बजाय अंशांकित Amplex UltraRed और हॉर्सरैडिश पेरॉक्सिडेज़ को प्राथमिकता दें, कैटालेज़ से सत्यापन करें और प्रकाश पर निर्भरता जाँचें, क्योंकि रंजक एक प्रकाश-संवेदीकारक है। मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया के अध्ययन में पाया गया कि केवल 100 nM रंजक पर पेरॉक्साइड भार चार गुने से अधिक बढ़ा, जबकि उसका निष्कासन धीमा हुआ। पेरॉक्साइड सीधे अपचयित रंजक से बना, बिना किसी सुपरऑक्साइड मध्यवर्ती के। प्रोब चयन और प्रकाश नियंत्रणों का विवरण रंजक प्रयोगों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के मापन पर साथ के लेख में दिया गया है। पेरॉक्साइड कब संकेत के रूप में और कब भार के रूप में काम करता है, इस व्यापक प्रश्न पर कोशिकीय रेडॉक्स संतुलन और एंटीऑक्सिडेंट दावों के साथ चर्चा की गई है।

मार्ग से जुड़े दावों के लिए कॉम्प्लेक्स III के दोनों अवरोधक स्थलों को जाँचें: Qi स्थल पर एंटीमाइसिन A और Qo स्थल पर माइक्सोथायज़ोल। साथ ही साइनाइड से कॉम्प्लेक्स IV का अंतिम परीक्षण करें। चूहे के मस्तिष्क पर एक पुराने अध्ययन में रंजक द्वारा रोटेनोन-अवरुद्ध श्वसन की बहाली बताई गई थी, लेकिन एंटीमाइसिन-अवरुद्ध श्वसन की नहीं। बाद में तीन प्रजातियों पर किए गए अध्ययन में दोनों अवरोधकों के साथ आंशिक कार्यबहाली और साइटोक्रोम c के सीधे अपचयन के साक्ष्य मिले। बाइपास को स्थापित तथ्य के बजाय नए आँकड़ों के अनुरूप संभावना मानें, क्योंकि रंजक की सांद्रता, अवरोधक का स्थल, सब्सट्रेट की अवस्था और रंजक का वितरण—सभी देखे जाने वाले मार्ग को बदलते हैं।

परीक्षण-चयन सारणी

प्रश्न के आधार पर मापन चुनने के लिए इस तालिका का उपयोग करें, न कि मापन के आधार पर प्रश्न चुनने के लिए।

न्यूनतम विश्वसनीय दावे के लिए रंजक की समान सांद्रताओं—100 nM, 300 nM, 1 uM और 2 uM—पर लीक, ADP, ऑलिगोमाइसिन और अनकपलर स्थितियों में ऑक्सीजन प्रवाह; ATP संश्लेषण दर; अधिमानतः दो प्रोब से झिल्ली विभव; और कैटालेज़ तथा कोशिका-रहित नियंत्रणों के साथ अंशांकित पेरॉक्साइड विमोचन मापना आवश्यक है। जुड़े हुए मापों का पूरा समूह रिपोर्ट करें: ऑक्सीजन प्रवाह, ATP दर, प्रति ऑक्सीजन ATP, विभव और पेरॉक्साइड। इनमें से कोई भी संख्या अकेले ऐसा मापन है, जिसका अर्थ अभी स्पष्ट किया जाना बाकी है।