मिथिलीन ब्लू का उपयोग अम्ल-प्रतिरोधी अभिरंजन में प्रतिरंजक के रूप में क्यों किया जाता है

एक तकनीशियन अभिरंजन का पूरा क्रम समाप्त होने के बाद थूक के स्मीयर की जाँच करता है। नीली पृष्ठभूमि पर लाल दंड स्पष्ट दिखते हैं और रिपोर्ट में लिखा जाता है कि अम्ल-प्रतिरोधी बैसिली देखे गए। अगले दिन दूसरी स्लाइड पर एक समान नीली पृष्ठभूमि दिखती है, जिसमें कोई लाल दंड नहीं है, और उसे तपेदिक के लिए नकारात्मक बताया जाता है। इन दोनों में से एक रिपोर्ट ऐसा दावा करती है जिसकी पुष्टि स्लाइड से नहीं होती, और वह पहली रिपोर्ट नहीं है।

भ्रम अवधारणा को लेकर है। तकनीशियन ने नीले रंग को जीवों का पता लगाने वाली रासायनिक प्रक्रिया का हिस्सा मान लिया, जैसे मिथिलीन ब्लू ने माइकोबैक्टीरिया खोजने में मदद की हो। उसने ऐसा नहीं किया। जब तक मिथिलीन ब्लू स्लाइड के संपर्क में आता है, परीक्षण पहले ही पूरा हो चुका होता है। यह रंजक केवल पृष्ठभूमि को रंगता है, ताकि परिणाम पढ़ा जा सके। यह लेख बताता है कि अम्ल-प्रतिरोधी अभिरंजन में मिथिलीन ब्लू का उद्देश्य क्या है, किसी दूसरे रंग के बजाय नीला रंग क्यों चुना जाता है और नीली पृष्ठभूमि पर लाल रंग दिखने से कौन-से निष्कर्ष निकाले जा सकते हैं।

संक्षिप्त उत्तर

अम्ल-प्रतिरोधी अभिरंजन एक विभेदक परीक्षण है, जो तीन सिद्धांतों पर आधारित है। प्राथमिक रंजक कार्बोल फ्यूशिन को मोम-जैसी परत वाले माइकोबैक्टीरिया सहित हर कोशिका में प्रवेश कराया जाता है। विरंजक अम्ल-अल्कोहल सामान्य कोशिकाओं से लाल रंजक हटा देता है, लेकिन अम्ल-प्रतिरोधी कोशिकाओं से उसे नहीं निकाल पाता। इसके बाद प्रतिरंजक मिथिलीन ब्लू उस सारी सामग्री को रंगता है, जिससे विरंजक ने रंग हटा दिया था। इसलिए गैर-अम्ल-प्रतिरोधी कोशिकाएँ, मेज़बान की कोशिकाएँ और मलबा नीले दिखते हैं, जबकि अम्ल-प्रतिरोधी बैसिली लाल रहते हैं। प्रतिरंजक रंगों के बीच दृश्य अंतर पैदा करता है। किसी कोशिका को अम्ल-प्रतिरोधी बनाने वाली रासायनिक प्रक्रिया में उसकी कोई भूमिका नहीं होती।

प्रत्येक चरण क्या करता है

नीचे दिया गया आरेख अलग-अलग चरणों की भूमिका दिखाता है। प्रक्रिया को समझने के लिए इसे बाएँ से दाएँ पढ़ें। नीचे की पट्टी याद दिलाती है कि अभिरंजन की प्रत्येक श्रेणी एक अलग प्रश्न का उत्तर देती है।

पहले रंजक का प्रवेश होता है। माइकोबैक्टीरिया सामान्य जलीय रंजकों के प्रवेश का प्रतिरोध करते हैं, क्योंकि उनका आवरण असामान्य रूप से जल-विकर्षी होता है। इसलिए प्रोटोकॉल में रंजक को भीतर पहुँचाने के उपाय किए जाते हैं। ज़ील-नील्सन विधि में गर्म करके भाप उत्पन्न करने से फिनॉल युक्त कार्बोल फ्यूशिन मोम-जैसी भित्ति के पार पहुँचता है। किन्यून की शीत विधि में गर्म करने के बजाय कहीं अधिक प्रबल प्राथमिक रंजक मिश्रण इस्तेमाल किया जाता है। कुछ संशोधित, बिना गर्म किए किए जाने वाले संस्करणों में पृष्ठ-सक्रिय पदार्थ भी मिलाए जाते हैं। अमेरिकन सोसाइटी फॉर माइक्रोबायोलॉजी के अम्ल-प्रतिरोधी अभिरंजन प्रोटोकॉल दोनों मिश्रणों को साथ-साथ दर्ज करते हैं। उनकी सांद्रता में बड़ा अंतर है: गर्म करने वाली विधि में प्रति 100 mL लगभग 0.3 g बेसिक फ्यूशिन, जबकि शीत विधि में लगभग 4 g।

दूसरे चरण में विभेदन होता है। अम्ल-अल्कोहल, जिसमें सामान्यतः 95 प्रतिशत एथेनॉल के 97 mL में 3 mL सांद्र हाइड्रोक्लोरिक अम्ल होता है, उन सभी कोशिकाओं से लाल रंजक धोकर निकाल देता है जिनकी भित्ति कोई विशेष प्रतिरोध नहीं देती। जिन कोशिकाओं का माइकोबैक्टीरियल लिपिड आवरण अक्षुण्ण है, वे रंजक को बनाए रखती हैं। पूरी विधि इसी चरण पर निर्भर करती है। तकनीक के प्रति सबसे अधिक संवेदनशील चरण भी यही है, जिसकी चर्चा नीचे की गई है।

अंत में रंगों का दृश्य अंतर पैदा किया जाता है। अब स्लाइड पर लाल अम्ल-प्रतिरोधी कोशिकाएँ होती हैं और जिन कोशिकाओं से रंजक निकल चुका है, उनकी पृष्ठभूमि लगभग रंगहीन होती है। 0.3 प्रतिशत w/v मिथिलीन ब्लू इस पृष्ठभूमि को फिर से दिखाई देने योग्य बनाता है, ऐसे रंग में जो लाल से अधिकतम अलग दिखता है। प्रतिरंजन का समय कम होता है। गर्म करने वाली विधि में यह आमतौर पर 20 से 30 सेकंड और शीत विधि के कुछ संस्करणों में कुछ मिनट तक होता है। यह समय प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, रंजक का अपना गुण नहीं है।

यही रंजक क्यों, और नीला रंग क्यों

मिथिलीन ब्लू एक धनायनिक क्षारीय रंजक है। इसका अर्थ है कि इसके रंगीन आयन पर धनात्मक आवेश होता है और वह विरंजित बैक्टीरिया, मेज़बान की कोशिकाओं तथा मलबे की ऋणात्मक आवेश वाली सतहों से बंधता है। ओपनस्टैक्स माइक्रोबायोलॉजी आवेश के इस संबंध को क्षारीय रंजकों का सामान्य सिद्धांत बताता है। लेकिन इस काम के लिए मिथिलीन ब्लू रासायनिक रूप से अद्वितीय नहीं है। क्रिस्टल वायलेट और सैफ्रेनिन भी क्षारीय रंजक हैं। यह चयन प्रकाशीय गुणों के आधार पर होता है, रासायनिक गुणों के आधार पर नहीं।

लाल दंडों को स्पष्ट दिखाने के लिए अलग रंग की पृष्ठभूमि चाहिए। उज्ज्वल-क्षेत्र सूक्ष्मदर्शिकी में नीला रंग लाल से सबसे उपयोगी दृश्य अंतर देता है। सैफ्रेनिन अच्छा प्रतिरंजक नहीं होगा, क्योंकि उसका अंतिम गुलाबी-लाल रंग कोशिकाओं में बने रहने वाले कार्बोल फ्यूशिन के रंग से बहुत मिलता-जुलता है। इससे प्रक्रिया द्वारा बनाया गया अंतर मिट जाता है। क्रिस्टल वायलेट गहरी बैंगनी पृष्ठभूमि बनाएगा, जो पतले लाल बैसिली की तरह ही ध्यान खींचेगी। इस भूमिका के रासायनिक होने के बजाय दृश्य अंतर पैदा करने की होने का सबसे मजबूत प्रमाण दूसरे रंजकों का उपयोग है: कुछ पशु-चिकित्सकीय और संशोधित प्रोटोकॉल में मैलाकाइट ग्रीन और ब्रिलियंट ग्रीन जैसे हरे प्रतिरंजक इस्तेमाल होते हैं। फिर भी परीक्षण काम करता है, क्योंकि स्पष्ट रूप से अलग दिखने वाला कोई भी रंग वही काम कर देता है।

इससे दो व्यावहारिक निष्कर्ष निकलते हैं। पहला, मानक मिश्रण में pH समायोजन का निर्देश नहीं है। इस साधारण जलीय 0.3 प्रतिशत घोल को लोएफ़लर के मिथिलीन ब्लू जैसे क्षारीय मिश्रणों से न मिलाएँ, जो अभिरंजन की अलग अवधारणा पर आधारित हैं। दूसरा, जरूरत से अधिक प्रतिरंजन नुकसान करता है। ऊतक-विज्ञान का साहित्य विशेष रूप से चेतावनी देता है कि अत्यधिक गहरी नीली पृष्ठभूमि कम संख्या में मौजूद बैसिली को छिपा सकती है। इसलिए स्लाइड को प्रोटोकॉल में निर्धारित समय से अधिक देर तक रंजक से ढके रखने से दृश्य स्पष्टता घटती है और कोई लाभ नहीं मिलता।

भित्ति की वह रासायनिक संरचना जो परीक्षण को संभव बनाती है

अम्ल-अल्कोहल के विभेदन का कारण माइकोबैक्टीरियल आवरण में है। उसका संरचनात्मक आधार माइकोलिल-अरेबिनोगैलेक्टन-पेप्टिडोग्लाइकैन संकुल है: पेप्टिडोग्लाइकैन अरेबिनोगैलेक्टन से जुड़ा होता है, जिसके बाहरी सिरों पर बहुत लंबी शृंखला वाले माइकोलिक अम्ल होते हैं। इससे लिपिड-समृद्ध बाहरी माइकोमेम्ब्रेन बनती है, जिसकी पारगम्यता असामान्य रूप से कम होती है। माइकोबैक्टीरिया की बाहरी झिल्ली की समीक्षा इस संरचना का विस्तृत वर्णन करती है। यह अवरोध दोनों दिशाओं में काम करता है। यह रंजक के प्रवेश का प्रतिरोध करता है, इसलिए प्रवेश के लिए गर्म करना या अधिक प्रबल प्राथमिक रंजक इस्तेमाल करना पड़ता है। यह रंजक को बाहर निकाले जाने का भी प्रतिरोध करता है, इसलिए कार्बोल फ्यूशिन के भीतर पहुँच जाने के बाद अम्ल-अल्कोहल उसे नहीं हटा पाता। सामान्य बैक्टीरिया में यह आवरण नहीं होता और उनका रंजक निकल जाता है। इसलिए अम्ल-प्रतिरोधिता को लिपिड अवरोध का परिणाम समझना अधिक उचित है, न कि फ्यूशिन का माइकोलिक अम्ल से रासायनिक रूप से बंधना।

यह रासायनिक संरचना एक सामान्य उलझन भी समझाती है: ग्राम विधि से माइकोबैक्टीरिया का अभिरंजन कमजोर और अनिश्चित होता है। कभी वे हल्के रंग की मनके-जैसी आकृतियों के रूप में दिखते हैं, तो कभी बिना रंगी धुँधली आकृतियों के रूप में। उनकी जल-विकर्षी भित्ति क्रिस्टल वायलेट के प्रवेश को सीमित करती है। अम्ल-प्रतिरोधी अभिरंजन, ग्राम अभिरंजन का संशोधित रूप नहीं है। यह भित्ति के एक अलग गुण पर आधारित अलग विभेदक सिद्धांत है। अन्य दो विधियों के लिए यह अंतर सरल अभिरंजन और ग्राम अभिरंजन की तुलना में दिखाया गया है।

तीन विधियाँ, तीन प्रश्न

एक रंजक वाली बैक्टीरियल विधियों की व्यापक श्रेणी के लिए सूक्ष्मदर्शिकी अभिरंजन एटलस देखें।

नीली पृष्ठभूमि पर लाल रंग क्या साबित नहीं कर सकता

लाल दंडों का अर्थ है कि जीवों ने अम्ल-अल्कोहल के संपर्क के बावजूद कार्बोल फ्यूशिन बनाए रखा। यह निष्कर्ष माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस के अनुरूप है, लेकिन तपेदिक के निदान पर CDC का मार्गदर्शन स्पष्ट रूप से बताता है कि अन्य माइकोबैक्टीरिया भी अम्ल-प्रतिरोधी होते हैं। इसलिए प्रजाति की पहचान के लिए संवर्धन और न्यूक्लिक अम्ल परीक्षण चाहिए, केवल रंग नहीं।

तकनीक संबंधी त्रुटियाँ मुख्यतः धुलाई के दो चरणों के आसपास होती हैं। अपर्याप्त विरंजन से पृष्ठभूमि की सामग्री लाल रह जाती है और गलत सकारात्मक व्याख्या की आशंका होती है। अत्यधिक विरंजन कमजोर रूप से बने हुए प्राथमिक रंजक को निकाल देता है और गलत नकारात्मक परिणामों में योगदान देता है। जरूरत से अधिक प्रतिरंजक लगाने से कम संख्या में मौजूद बैसिली नीले रंग में छिप जाते हैं। मोटे स्मीयर, अवक्षेपित अभिकर्मक और दूषित धुलाई का पानी भी अपनी-अपनी कृत्रिम आकृतियाँ पैदा करते हैं।

तकनीक कितनी भी अच्छी हो, संवेदनशीलता जीवों की संख्या से सीमित रहती है। पारंपरिक स्मीयर सूक्ष्मदर्शिकी के लिए प्रति मिलीलीटर थूक में लगभग 5,000 से 10,000 बैसिली चाहिए। CDC की पुरानी साक्ष्य समीक्षाओं में संवर्धन से पुष्ट फुफ्फुसीय मामलों में स्मीयर की संवेदनशीलता लगभग 45 से 80 प्रतिशत बताई गई थी। इसलिए नकारात्मक स्मीयर कभी भी तपेदिक की संभावना को खारिज नहीं करता। वर्तमान CDC मार्गदर्शन में हर स्मीयर के साथ संवर्धन भी रखा गया है। जब फुफ्फुसीय तपेदिक की संभावना पर विचार किया जा रहा हो और परिणाम से प्रबंधन बदल सकता हो, तो कम से कम एक श्वसन नमूने पर न्यूक्लिक अम्ल प्रवर्धन परीक्षण की सिफारिश की जाती है।

व्यावहारिक काम अधिकृत प्रोटोकॉल के अनुसार होना चाहिए

इस लेख सहित शिक्षण के लिए दिए गए विवरण नैदानिक काम करने की अनुमति नहीं देते। प्रयोगशाला में काम करने के लिए उसकी मान्यीकृत मानक संचालन प्रक्रिया का पालन करें, जो वर्तमान CDC, APHL या CLSI दस्तावेज़ों के अनुरूप हो। CDC के स्टैक्स संग्रह में उपलब्ध अम्ल-प्रतिरोधी अभिरंजन संदर्भ दिखाता है कि ऐसी प्रक्रियाएँ अभिकर्मकों और परिणाम पढ़ने के तरीकों को कैसे निर्धारित करती हैं। तपेदिक के नमूनों पर काम करने के लिए जैविक जोखिम को सीमित रखने की व्यवस्था जरूरी है: स्मीयर जैविक सुरक्षा कैबिनेट में तैयार किए जाते हैं, क्योंकि तैयारी के दौरान एरोसोल और छींटे बनते हैं। CDC के प्रयोगशाला सुरक्षा मार्गदर्शन के अनुसार, गर्म करके स्थिर किए गए स्मीयर में भी जीवित तपेदिक बैसिली हो सकते हैं और उन्हें फिर भी दूषित सामग्री की तरह संभालना चाहिए। एम. लेप्रे की जाँच के लिए कार्बोल फ्यूशिन और मिथिलीन ब्लू से अभिरंजित स्मीयर की CDC पब्लिक हेल्थ इमेज लाइब्रेरी प्रविष्टि याद दिलाती है कि इस विधि का उपयोग तपेदिक से आगे भी होता है: जहाँ भी अम्ल-प्रतिरोधी जीवों की खोज की जाती है, नीली पृष्ठभूमि पर लाल रंग का यही अंतर काम आता है। सावधानी से पढ़ा गया नकारात्मक परिणाम भी दर्ज करने योग्य परिणाम है।

तैयार स्लाइड को पढ़ना

प्रारंभिक जाँच के दौरान प्रतिरंजक की उपयोगिता स्पष्ट होती है। कम आवर्धन पर स्लाइड को देखने वाला सूक्ष्मदर्शी विशेषज्ञ पहले नीली पृष्ठभूमि से स्मीयर की गुणवत्ता आँकता है: कोशिकाओं का समान वितरण, फोकस करने के लिए अक्षुण्ण मेज़बान कोशिकाएँ और भारी अवक्षेप का अभाव। इसके बाद लाल संभावित जीव ध्यान खींचते हैं, क्योंकि स्लाइड पर और कुछ लाल नहीं होता। पुष्टि तेल निमज्जन के अंतर्गत की जाती है, जहाँ वास्तविक बैसिली अपेक्षित पतले दंडों के रूप में दिखाई देते हैं। ये कभी थोड़े घुमावदार या मनके-जैसे होते हैं, एक समान रंजक मलबे जैसे नहीं।

पृष्ठभूमि का अभिरंजन रिपोर्ट की शब्दावली भी तय करता है। लाल बैसिली वाली स्लाइड की रिपोर्ट में लिखा जाता है कि अम्ल-प्रतिरोधी बैसिली देखे गए। अक्सर प्रयोगशाला के पैमाने के अनुसार अर्धमात्रात्मक श्रेणी भी दी जाती है। जिस स्लाइड में कोई लाल जीव नहीं दिखता, उसकी रिपोर्ट में लिखा जाता है कि अम्ल-प्रतिरोधी बैसिली नहीं देखे गए, कभी भी यह नहीं कि तपेदिक के लिए नकारात्मक है। यह अंतर इसलिए महत्वपूर्ण है क्योंकि नीली पृष्ठभूमि पुष्टि करती है कि अभिरंजन ने काम किया, कोशिकाओं ने प्रतिरंजक ग्रहण किया और प्रकाशीय व्यवस्था पर्याप्त थी। लेकिन इससे उन जीवों के बारे में कुछ नहीं पता चलता जिनकी संख्या पहचान की सीमा से नीचे है। केवल नीली पृष्ठभूमि दिखना स्लाइड के बारे में एक मान्य परिणाम है, रोगी के बारे में अंतिम निर्णय नहीं।

अलग-अलग चरणों की भूमिका याद रखें, तो रिपोर्ट लिखना स्पष्ट हो जाता है। कार्बोल फ्यूशिन संभावित जीवों को चिह्नित करता है। अम्ल-अल्कोहल परीक्षण करता है। मिथिलीन ब्लू केवल उत्तर को पढ़ने योग्य बनाता है: लाल का अर्थ है कि अम्ल के बावजूद रंजक बना रहा, नीले का अर्थ है कि वह निकल गया। बाकी सब, प्रजाति, जीवों की संख्या और नैदानिक अर्थ, स्लाइड से आगे किए जाने वाले काम से पता चलता है।