लोएफ़्लर के क्षारीय और पॉलीक्रोम मेथिलीन ब्लू रंजकों की व्याख्या

रंजन की कार्यमेज़ पर तीन बोतलें एक साथ रखी हो सकती हैं, और हर बोतल पर मेथिलीन ब्लू के किसी रूप का नाम लिखा हो सकता है। एक पर जलीय मेथिलीन ब्लू 1% लिखा है। दूसरी पर लोएफ़्लर का क्षारीय मेथिलीन ब्लू। तीसरी पर पॉलीक्रोम मेथिलीन ब्लू। व्यस्त कर्मचारी सबसे पास रखी बोतल उठा लेता है। फिर स्मीयर बहुत हल्का रंगता है, या एकसमान नीला हो जाता है, या उसमें बैंगनी रंग की अप्रत्याशित छटाएँ दिखती हैं, और परिणाम के लिए नमूने को दोष दिया जाता है।

यह संघटन की समस्या है, नमूने की समस्या नहीं। इन तीनों विलयनों में संबंधित रंजक होते हैं, लेकिन इनके रंजन सिद्धांत अलग हैं। एक लगभग उदासीन pH पर साधारण धनायनिक रंजक है। दूसरे में उसी रंजक की क्रिया क्षार से अधिक तीव्र की गई है। तीसरा अब एकल रंजक है ही नहीं, बल्कि जानबूझकर ऑक्सीकृत किया गया मिश्रण है। गलत विलयन चुनने पर रंजन का सिद्धांत ही बदल जाता है।

संक्षिप्त उत्तर

साधारण जलीय मेथिलीन ब्लू आधारभूत विकल्प है: पानी में लगभग 1% रंजक, जो जीवाणुओं की आकारिकी और सामान्य सूक्ष्मदर्शिकी के लिए एक साधारण धनायनिक रंजक है। लोएफ़्लर के क्षारीय मेथिलीन ब्लू में पानी से तनु किए गए ऐल्कोहॉलिक स्टॉक विलयन में तनु क्षार की थोड़ी, मापी हुई मात्रा मिलाई जाती है। इससे pH बढ़ता है और धनायनिक रंजक जीवाणुओं की अम्लीय संरचनाओं से अधिक मजबूती से बंधता है। पॉलीक्रोम मेथिलीन ब्लू वह मेथिलीन ब्लू है जिसे क्षारीय माध्यम में ऑक्सीकरण द्वारा जानबूझकर परिपक्व किया गया है। इसलिए बोतल में बचे हुए मेथिलीन ब्लू के साथ डीमेथिलीकृत समजातों (एज़्योर A, azure B, एज़्योर C), थायोनिन और मेथिलीन वायलेट का मिश्रण होता है, और यह मिश्रण अलग-अलग संरचनाओं को अलग-अलग रंगों में रंगता है।

यदि केवल एक वाक्य याद रखें: क्षारीकरण रंजन की तीव्रता बदलता है, जबकि पॉलीक्रोमिंग रंजन के रंग बदलती है।

साधारण जलीय मेथिलीन ब्लू: तुलना का आधार

सबसे सरल संघटन पानी में घुला मेथिलीन ब्लू है, जिसकी सांद्रता सामान्यतः 1% w/v होती है और जिसमें न क्षार होता है, न ऑक्सीकरण किया जाता है। रंग प्रदान करने वाला रासायनिक रूप मेथिलथायोनिनियम धनायन है, जिसके साथ क्लोराइड प्रतिआयन होता है। यह एक छोटा, समतल फ़ीनोथायाज़ीन रंजक है, जिसे PubChem के मेथिलीन ब्लू अभिलेख में मेथिलथायोनिनियम क्लोराइड कहा गया है। धनायन होने के कारण यह न्यूक्लिक अम्लों के फ़ॉस्फ़ेट ढाँचों और जीवाणु कोशिका भित्तियों के अम्लीय समूहों से बंधता है, जिससे हल्की पृष्ठभूमि पर कोशिकाएँ नीली दिखती हैं।

इसकी विशेषता पूर्वानुमेय परिणाम है। केंद्रक और जीवाणु नीले दिखाई देते हैं। कंट्रास्ट सीमित होता है। हल्के दिखाई देने वाले जीवों का रंजन कमज़ोर हो सकता है, और लोएफ़्लर ने इसी सीमा को दूर करने का प्रयास किया था। यह विलयन साधारण जीवाणु रंजकों के जिस व्यापक समूह का हिस्सा है, उसके बारे में जानने के लिए जीवाणुओं के सरल रंजन का अवलोकन देखें। यहाँ भी सही रासायनिक पहचान आवश्यक है: मेथिल ब्लू पूरी तरह अलग अणु है, जैसा कि मेथिल ब्लू और मेथिलीन ब्लू की तुलना में बताया गया है। इसलिए केवल रंग के नाम से कैटलॉग में खोजने पर गलत वर्ग का रंजक मिल सकता है।

लोएफ़्लर का क्षारीय मेथिलीन ब्लू: वही रंजक, अधिक तीव्र क्रिया

लोएफ़्लर की पारंपरिक विधि में मेथिलीन ब्लू के ऐल्कोहॉलिक स्टॉक विलयन को पानी में तनु क्षार के साथ मिलाया जाता है। पाठ्यपुस्तकों में दिए गए संस्करणों में 30 mL 95% एथेनॉल में 0.3 g रंजक और 100 mL 0.01% जलीय पोटैशियम हाइड्रॉक्साइड मिलाने को कहा जाता है। इसका समतुल्य संघटन 30 mL संतृप्त ऐल्कोहॉलिक मेथिलीन ब्लू, 100 mL आसुत जल और 1 mL 1% KOH है। इससे स्पष्ट रूप से क्षारीय pH वाला कार्यशील विलयन बनता है, जिसमें रंजक की सांद्रता लगभग 0.3% होती है। व्यावसायिक संस्करण भी इसी सिद्धांत पर आधारित हैं, और Thermo Fisher के सूक्ष्मजीवविज्ञान रंजकों के कैटलॉग में लोएफ़्लर के क्षारीय मेथिलीन ब्लू, पॉलीक्रोम और जलीय संस्करणों को अलग-अलग नियत उपयोगों वाले अलग कैटलॉग उत्पादों के रूप में सूचीबद्ध किया गया है।

इस विधि का मुख्य आधार क्षार है। pH बढ़ने पर नमूने के कार्बोक्सिल और फ़ॉस्फ़ेट समूहों का डीप्रोटोनीकरण होता है, जिससे ऋणात्मक स्थलों का घनत्व बढ़ता है। साथ ही, एथेनॉल स्टॉक विलयन रंजक को पूरी तरह घुला रखता है, जिससे वह इन स्थलों तक एकल-अणु रूप में पहुँचता है। परिणामस्वरूप, उदासीन जलीय रंजक की तुलना में जीवाणुओं का रंजन अधिक तेज़ और तीव्र होता है। सामान्य जीवाणुविज्ञानीय स्मीयर में परिचित गहरे नीले दंडाकार जीवाणु और कोक्कस दिखाई देते हैं। रंजन में सामान्यतः एक से तीन मिनट लगते हैं, जिसके बाद पानी से धोया जाता है।

इसका पारंपरिक उपयोग लोएफ़्लर सीरम माध्यम पर उगाए गए Corynebacterium diphtheriae के लिए है: पतले, अक्सर गदाकार दंडाकार जीवाणु, जिनमें संचित पॉलीफ़ॉस्फ़ेट के मेटाक्रोमैटिक बेब्स-अर्न्स्ट कणिकाएँ गहराई से रंगती हैं। माध्यम और रंजक की यह जोड़ी ऐतिहासिक है। दोनों का श्रेय उसी जीवाणुविज्ञानी को दिया जाता है, और कणिकाओं का स्पष्ट कंट्रास्ट इसका नैदानिक लाभ है। डिप्थीरिया संबंधी कार्य के अलावा, यह रंजक कल्चर से बने स्मीयरों के सामान्य जीवाणुविज्ञानीय रंजन, नैदानिक स्मीयरों में Neisseria की आकारिकी और उन स्थितियों में काम आता है जहाँ ग्राम रंजन आवश्यक नहीं है लेकिन साधारण जलीय ब्लू बहुत हल्का पड़ता है। यह एकवर्णी रंजक है। हर अम्लीय संरचना नीले रंग की किसी छटा में रंगती है। जब किसी प्रोटोकॉल में रंगों के आधार पर विभेदन अपेक्षित हो, तो अकेला क्षार उसे प्रदान नहीं कर सकता।

एक व्यावहारिक सावधानी: क्षारीय रंजक विलयन भंडारण और कार्बन डाइऑक्साइड के अवशोषण से खराब होते हैं और उनमें अवक्षेप बनता है। प्रयोगशालाएँ या तो सीमित मात्रा तैयार करती हैं या कैटलॉग वाला विलयन खरीदकर उसकी निर्धारित भंडारण अवधि का पालन करती हैं। वे ऐसी पुरानी बोतल को चलाते रहने से बचती हैं जो अब हर स्लाइड पर तलछट छोड़ती है।

पॉलीक्रोम मेथिलीन ब्लू: एक नाम, कई रंजक

पॉलीक्रोम मेथिलीन ब्लू की शुरुआत उसी रंजक से होती है, लेकिन उसे क्षारीय माध्यम में नियंत्रित ऑक्सीकरण से गुज़ारा जाता है। ऐतिहासिक रूप से इस प्रक्रिया को परिपक्वन या पॉलीक्रोमिंग कहा जाता था। क्षारीय माध्यम में समय के साथ परिवर्तन, कार्बोनेट के साथ गर्म करना या डाइक्रोमेट जैसे कारकों से ऑक्सीकरण, डाइमेथिलअमीनो प्रतिस्थापी समूहों से चरणबद्ध तरीके से मेथिल समूह हटाता है। इससे एक मिश्रण बनता है: बचा हुआ मेथिलीन ब्लू, azure B (एक मेथिल समूह हटा हुआ), एज़्योर A और एज़्योर C (आगे डीमेथिलीकरण के उत्पाद), थायोनिन (पूरी तरह डीमेथिलीकृत) और मेथिलीन वायलेट परिवार के ऑक्सीकरण से बने सह-उत्पाद। प्रत्येक घटक की अपनी रंगत और ऊतकों के प्रति बंधन-प्रवृत्ति होती है। इसलिए मिश्रण मेटाक्रोमैटिक रंजन करता है: केंद्रक, कणिकाएँ, म्यूसिन और उपास्थि, प्रत्येक में नीले से लाल-बैंगनी तक अलग-अलग रंगतें आती हैं।

यही रसायन प्रसिद्ध रक्त रंजकों का भी आधार है। शुरुआती शोधकर्ताओं ने पाया कि क्षारीकृत मेथिलीन ब्लू मलेरिया परजीवी के केंद्रकों को बैंगनी रंग की छटाओं में रंगता था, लेकिन उनके जलीय परिपक्व विलयन अस्थिर थे और कुछ ही दिनों में उनमें अवक्षेप बन जाता था। बैंगनी रक्त रंजक का आविष्कार कैसे हुआ विषय की समीक्षा बताती है कि 1891 में मालाखोव्स्की और रोमानोव्स्की ने स्वतंत्र रूप से इस प्रभाव का उपयोग कैसे किया, रंजक के अवक्षेप को स्थिर करने और बिना गर्म किए रक्त की पतली परतों को स्थिर करने के लिए मेथेनॉल कैसे अपनाया गया, और बाद में गीम्सा ने ग्लिसरॉल से स्थिरीकरण के साथ मापी हुई मात्रा में azure B और ईओसिन के मिश्रण को कैसे मानकीकृत किया। आधुनिक गीम्सा-प्रकार के रंजक सीधे पॉलीक्रोम मेथिलीन ब्लू और ईओसिन से विकसित हुए हैं। यही संयोजन रोमानोव्स्की प्रभाव उत्पन्न करता है। ईओसिन के साथ संयोजन और azure B घटक के विवरण के लिए रोमानोव्स्की-प्रकार के रंजक और azure B तथा ईओसिन की अंतःक्रिया देखें।

मिश्रण होने के कारण पॉलीक्रोम मेथिलीन ब्लू स्वभावतः इन तीनों में सबसे कम मानकीकृत है। इसकी रंगतों का सटीक संतुलन ऑक्सीकरण की विधि और सीमा पर निर्भर करता है। इसी कारण ऊतकविज्ञान सामग्री के आपूर्तिकर्ता इसे समय के साथ बदले हुए लोएफ़्लर विलयन के रूप में बेचने के बजाय, अपने प्रदर्शन परीक्षणों वाले एक अलग उत्पाद के रूप में बेचते हैं। इसके सामान्य उपयोगों में मास्ट कोशिकाओं की कणिकाओं, म्यूसिन और उपास्थि का मेटाक्रोमैटिक प्रदर्शन, प्लाज़्मा कोशिकाओं के सूक्ष्म विवरण और गुडपैस्चर-प्रकार की पॉलीक्रोम विधियों से ऊतक खंडों में Helicobacter pylori का प्रदर्शन शामिल हैं। जब उद्देश्य रंग के आधार पर विभेदन हो, तो यह सही विकल्प है। जब प्रोटोकॉल में जीवाणुओं की स्पष्ट एकवर्णी आकृति अपेक्षित हो, तो यह गलत विकल्प है।

संघटन और उद्देश्य की तुलना

तालिका को विकल्प चुनने की प्रक्रिया के रूप में पढ़ें। यदि नमूना बहुत हल्का रंगता है, तो pH पर आधारित दृष्टिकोण बदलें और लोएफ़्लर का विलयन चुनें। यदि सब कुछ रंगता है लेकिन किसी संरचना का अलग पहचान योग्य रंग नहीं बनता, तो रंजक का सिद्धांत बदलें और पॉलीक्रोम चुनें। यदि लोएफ़्लर से रंगे स्मीयर में कणिकाएँ बहुत स्पष्ट दिखती हैं, लेकिन पर्यवेक्षक पूछता है कि केंद्रक और कोशिकाद्रव्य एक ही नीले रंग में क्यों हैं, तो उत्तर है कि कोई भी क्षारीय एकवर्णी रंजक उन्हें अलग-अलग रंगों में नहीं दिखा सकता। यह आवश्यकता पॉलीक्रोम परिवार और उसके रक्त रंजक व्युत्पन्नों से संबंधित है।

सामान्य भ्रमों से बचना

अधिकांश भ्रम दो गलतियों से पैदा होता है। पहली है लोएफ़्लर के विलयन को साधारण मेथिलीन ब्लू के बदले इस्तेमाल करने योग्य मानना, क्योंकि दोनों बोतल में नीले दिखते हैं। उनके pH और रंजन की तीव्रता अलग हैं। जहाँ लोएफ़्लर का विलयन निर्दिष्ट हो, वहाँ उदासीन रंजक लगाने से कणिकाओं का वही कंट्रास्ट खो जाता है जिसके लिए प्रोटोकॉल बनाया गया था। दूसरी गलती है किसी भी पुराने या अनायास समय के साथ बदले हुए क्षारीय ब्लू को पॉलीक्रोम मान लेना। अनियंत्रित रूप से समय के साथ बदलने पर अज्ञात सांद्रता का अज्ञात मिश्रण बनता है, जबकि वास्तविक पॉलीक्रोम विलयन निर्धारित ऑक्सीकरण विधियों से तैयार किए जाते हैं और रक्त रंजकों की परंपरा में उन्हें ईओसिन की मापी हुई मात्रा के साथ मिलाया जाता है। यहाँ इतिहास एक उपयोगी सबक देता है: 1890 के दशक के अस्थिर जलीय परिपक्व विलयनों का स्थान मेथेनॉल-आधारित स्थिर संघटनों ने ठीक इसलिए लिया क्योंकि अनियंत्रित मिश्रणों को दोबारा उसी रूप में तैयार नहीं किया जा सकता था। अज्ञात आयु वाली बोतल से किसी नैदानिक स्लाइड का रंजन करने से पहले यह सबक याद रखना उपयोगी है।

सही नाम की पुष्टि इस भ्रम को दूर करती है। रंग से अनुमान लगाने के बजाय लेबल पर कैटलॉग उत्पाद (जलीय, लोएफ़्लर या पॉलीक्रोम), रंजक की मात्रा और नियत उपयोग की पुष्टि करें। इन तीनों संघटनों का मूल क्रोमोफ़ोर एक ही है। इनके उद्देश्य अलग हैं।