מתילן כחול וברטונלה: ממצאי מעבדה ומגבלות הראיות הקליניות

צלחת תרבית ומטופל חולקים מילה אחת, זיהום, אך לא את אותו המושג. בצלחת, זיהום הוא ספירת מושבות על אגר. אצל המטופל, מדובר בחיידקים בתוך תאים וכלי דם, בתרופות הנעות בדם וברקמות, ובמערכת חיסון שעושה חלק מהעבודה. כשמבלבלים בין השניים, נתון מעבדתי מרשים מתחיל להיראות כמו טיפול. כשמפרידים ביניהם, אותו נתון נשאר מה שהוא: סיבה לערוך את הניסוי הבא.

ההפרדה הזאת היא כל מטרתה של הסקירה על מתילן כחול וברטונלה. שני מחקרי מעבדה מאותה קבוצת מחקר בדקו מתילן כחול נגד Bartonella henselae במצבים שבהם החיידק אינו גדל. שניהם דיווחו על פעילות חזקה בכלי זכוכית ופלסטיק. אף אחד מהם לא בדק אדם.

מדוע חוקרים בודקים את שלב העמידה

רוב בדיקות האנטיביוטיקה משתמשות בתאים הגדלים באופן פעיל. המודל הזה מחמיץ מקרה קשה יותר: תאים שהפסיקו להתחלק וסובלים חשיפה לתרופות שהורגות את התאים המקבילים להם שעדיין גדלים.

ברטונלה יכולה להתמיד בגוף, לרבות בתוך תאי דם אדומים ותאי אנדותל. לכן הקבוצה שאלה אילו תרופות מאושרות יכולות להרוג B. henselae לאחר שנכנסה לשלב העמידה. ריכוז מעכב מזערי, MIC, נמוך נגד תאים גדלים לא ניבא הרג בשלב העמידה. לריפמפין היה MIC נמוך מאוד, אך הוא הרג תאים בשלב העמידה במידה מועטה, ואילו תרכובות בעלות ערכי MIC גבוהים יותר הרגו אותם היטב. קוראים המעוניינים בשיטה כללית לקריאת מאמרים מסוג זה ימצאו אותה במדריך לקריאת מחקרים על מתילן כחול.

הסריקה הראשונה: לי ועמיתיו, 2019

סריקת שלב העמידה מ־2019 בכתב העת Antibiotics השתמשה בזן יחיד, B. henselae JK53, שגודל במצע Schneider עם 10 אחוזים סרום עוברי של בקר, בטמפרטורה של 37 C ובנוכחות 5 אחוזים CO2. תרביות בנות יום אחד הכילו בעיקר תאים מפוזרים שהתחלקו. תרביות בנות חמישה ימים, בריכוז של כ־10 בחזקת 8 יחידות יוצרות מושבה ל־mL, נחשבו לתרביות בשלב העמידה והכילו צברים נראים לעין.

הבדיקה השתמשה ב־SYBR Green I ובפרופידיום יודיד, וכוילה באמצעות תערובות של תאים חיים ותאים שהומתו באיזופרופנול. מכיוון שלמתילן כחול צבע עז, תוצאות שהצביעו על פעילות אושרו במיקרוסקופיה ולאחר מכן בספירת מושבות על אגר דם, מדד התוצאה המחמיר יותר.

מתוך 1,581 תרופות מאושרות בריכוז של 50 micromolar, מתילן כחול הותיר חיוניות של 16 אחוזים לפי קורא הפלטות ושל 25 אחוזים לפי המיקרוסקופיה. דפטומיצין הניב 21 אחוזים, כמה אזולים הניבו 22 עד 27 אחוזים, גנטמיצין 32 אחוזים, אריתרומיצין 66 אחוזים וציפרופלוקסצין 74 אחוזים. פירוויניום פמואט נראה פעיל יותר בקורא הפלטות, אך אי אפשר היה להעריך אותו במיקרוסקופיה בשל הפלואורסצנציה שלו עצמו.

נגד B. henselae הגדלה באופן פעיל, ה־MIC של מתילן כחול היה 0.08 עד 0.16 micrograms per mL. נגד תאים בשלב העמידה מתרבית בת חמישה ימים, בריכוז של 5 micrograms per mL, ספירת המושבות ירדה לרמה שבה לא זוהו מושבות לאחר יום אחד של חשיפה, בדומה לדפטומיצין ולפירוויניום פמואט בריכוזים שנבדקו. בניסוי נפרד של הרג לאורך זמן נעשה שימוש ב־10 micrograms per mL. אלה רמות חשיפה מעבדתיות, לא מינונים, והמאמר מציג אותן כך. ערך מצוטט של ריכוז שיא בפלזמה בבני אדם, הקרוב ל־3.9 micrograms per mL, מופיע במאמר רק כהקשר רקע. הסקירה על הפרמקוקינטיקה של מתילן כחול מסבירה מדוע אי אפשר לפרש ערך בפלזמה כערך ברקמה.

שתי מגבלות מצוינות במפורש במאמר. לא היה מודל ביופילם, ולא נבדקו שילובים עם מתילן כחול. הצברים בני חמשת הימים היו צברי תאים בתרבית נוזלית בשלב העמידה, ולא ניסוי ביופילם מתוקף. המחברים קראו למחקרים בבעלי חיים, למחקרי שילובים, למחקרי ביופילם ולבדיקות במיני ברטונלה אחרים.

שילובים ותאים שמקורם בביופילם: ג׳נג ועמיתיו, 2020

מחקר ההמשך מ־2020 בכתב העת BMC Microbiology השתמש באותו זן ובאותו מצע, אך עבר לתרביות בנות שישה ימים בשלב העמידה והוסיף שני דברים שחסרו במאמר הראשון: שילובי שתי תרופות ומודל של תאים שמקורם בביופילם.

בבדיקת תרופות יחידות בריכוז אחיד של 5 micrograms per mL למשך 24 שעות, מתילן כחול הותיר 3.2 כפול 10 בחזקת 4 יחידות יוצרות מושבה ל־mL, לעומת ביקורת עם כ־2.8 כפול 10 בחזקת 10. ציפרופלוקסצין, גנטמיצין וניטרופורנטואין הותירו פחות מושבות באותה נקודת זמן. התוצאה הזאת שונה מתוצאת 2019, שבה באותו ריכוז נומינלי לא זוהו מושבות לאחר יום אחד. גיל התרבית, צפיפותה ואופן הטיפול בה היו שונים, ולכן ההרג היה ניתן לשחזור מבחינת כיוון ההשפעה, אך לא היה זהה בהיקפו. ההבדל הזה בין ניסויים הוא אחת הסיבות לכך שבדיקות הבטיחות והאינטראקציות המקובלות מתייחסות לעוצמת הפעילות במעבדה בנפרד מההשפעה הקלינית.

סריקת השילובים היא החלק המצוטט ביותר. ריכוזו של כל מרכיב נקבע ל־5 micrograms per mL. הן אזיתרומיצין עם מתילן כחול והן ריפמפין עם מתילן כחול הביאו לכך שלא זוהו מושבות משלב העמידה לאחר 24 שעות, וכך גם שני השילובים עם ציפרופלוקסצין. רק ארבעת השילובים האלה, מתוך 25 שנבדקו, הניבו תוצאה זו. לא נערך ניתוח סינרגיה פורמלי, ולכן המונח הנכון הוא שילוב פעיל בתנאים אלה, ולא סינרגיה מוכחת.

ניסוי הביופילם בדק תאים שנאספו מביופילם צעיר שפורק, ולא חדירה לביופילם בשל שנותר שלם. התרביות גודלו במשך חמישה ימים, דוללו לתוך פלטות באריות למשך חמישה ימים נוספים, אושרו באמצעות צביעת קריסטל ויולט, ואז גורדו לפני החשיפה לתרופות. בריכוז של 5 micrograms per mL, מתילן כחול לבדו הוריד את הספירה ל־2.3 כפול 10 בחזקת 2 עד יום 6, אחת התוצאות הטובות ביותר בין החומרים היחידים, אך לא לאפס. שני השילובים עם מתילן כחול הגיעו לאפס עד יום 6, וכך גם שני השילובים עם ציפרופלוקסצין.

המחברים הדגישו את אותן מגבלות שקורא זהיר היה מזהה: ביופילם צעיר שגורד, ולא ביופילם ותיק ושלם; ריכוז נוח אחד לכל התרופות במקום ריכוז שיא מציאותי נפרד לכל תרופה; רק שילובים נבחרים שהתמקדו באזיתרומיצין או בריפמפין; זן אחד; ללא בעלי חיים וללא מטופלים. הוצע מחקר המשך בשלוש תרופות, אך לא דווח על ביצועו.

השוואת תכנון המחקרים

הטבלה מציגה בתמצית את המסר של המאמר הזה. כל מה שמופיע לפני העמודה האחרונה הוא עבודה בתרבית. שום דבר באף אחד משני המאמרים אינו שייך לעמודה האחרונה.

ברטונלה אינה בורליה

שני המאמרים מזכירים את Borrelia burgdorferi, החיידק הספירוכטי הגורם למחלת ליים, משום שבדיקת הצבע התבססה על מחקר קודם באותה מעבדה על בורליה בשלב העמידה, שבו גם מתילן כחול ודפטומיצין זוהו כחומרים פעילים. ההיסטוריה הזאת מספקת הקשר מועיל, אך היא גם מקור נפוץ לטעויות.

אף ניסוי בשני מאמרי הברטונלה אינו בודק בורליה לצד ברטונלה. האורגניזמים שונים, מצעי הגידול שונים, הריכוזים שונים, וההשפעה המשוערת של מתילן כחול על הממברנה בברטונלה הוצגה כהשערה שדורשת מחקר נוסף. אין להשליך תוצאות ממין אחד לאחר, ואף אחד מהמאמרים אינו תומך בטענות רחבות על טפילים. ההשוואה בין תאי בורליה וברטונלה במצב התמדה מפרידה בין שתי ספרויות המחקר מסיבה זו.

מדוע תרביות אינן הופכות לפרוטוקול

העניין בחיפוש אחר פרוטוקול מתילן כחול לברטונלה מובן. המאמרים האלה הם הסיבה שיש להתייחס לביטוי הזה כנורת אזהרה ולא כרשימת קניות.

ראשית, 5 micrograms per mL בבארית אינם מרשם. הנתון הזה אינו כולל ספיגה, פיזור, קשירה לחלבונים, חדירה לתאים או סבילות. המחברים בחרו בו כממוצע גס של ריכוזי שיא של אנטיביוטיקה, וציינו שמחקר עתידי צריך להשתמש בריכוז מציאותי נפרד לכל תרופה.

שנית, אפס מושבות פירושו שלא נוצרו מושבות בתנאי הזריעה האלה, ולא שהרקמה סטרילית. תאים במצב התמדה, חיידקים תוך־תאיים ומגבלות דגימה נמצאים כולם מחוץ לתחומה של צלחת האגר.

שלישית, שילובים שמעקרים בארית יכולים להיכשל או להזיק בגוף. אזיתרומיצין עם מתילן כחול וריפמפין עם מתילן כחול הם שילובים מעבדתיים ברמות חשיפה מעבדתיות. ללא נתוני פרמקוקינטיקה בבעלי חיים ונתונים מבוקרים בבני אדם, אין מינון, אין משך טיפול ואין יחס תועלת־סיכון. כל מי ששוקל אפשרויות צריך לדון בהן עם גורם רפואי ולסקור מתי השימוש במתילן כחול דורש השגחה רפואית, לפני הסקת מסקנה כלשהי מנתוני צלחת תרבית.

המסקנה המצומצמת שהמאמרים האלה אכן תומכים בה היא זו: למתילן כחול פעילות הניתנת לשחזור נגד B. henselae JK53 שאינה גדלה, בתנאי מעבדה, לרבות בשילובי שתי תרופות במעבדה. התוצאות החזקות ביותר בשילובים ובתאים שמקורם בביופילם התקבלו במחקר מ־2020. כל השאר, לרבות השאלה אם לפעילות הזאת יש משמעות לברטונלוזיס בבני אדם, נותר ללא בדיקה.