מאמר
האם צריכת חמצן מוגברת פירושה יותר ATP? לקחים ממחקרים על מתילן כחול
מיטוכונדריון מבודד נמצא בתא מדידה עם דלק, אך ללא ADP. הוא צורך חמצן באיטיות. מוסיפים ADP, וצריכת החמצן מזנקת פי כמה. ממתינים עד שה-ADP אוזל, וצריכת החמצן יורדת בחזרה. הדלק לא השתנה. רק הדרישה ל-ATP השתנתה.
הרצף הקצר הזה ממחיש את כל ההבחנה שבה עוסק המאמר. צריכת חמצן מודדת את מהירות זרימת האלקטרונים דרך שרשרת הנשימה אל החמצן. ייצור ATP מודד כמה מהזרימה הזאת נאגר כאנרגיה שימושית. לשני התהליכים יש שלב ביניים משותף: מפל הפרוטונים משני צדי הממברנה הפנימית של המיטוכונדריון. כל דבר שמשנה את מידת הצימוד בין המפל לסינתזת ATP יכול להניע את שני מדדי התוצאה בכיוונים שונים. מתילן כחול הוא דוגמה מועילה כאן, משום שנצפה פועל בשתי הדרכים: בחלק מההכנות הניסיוניות הוא הגביר את צריכת החמצן לצד עלייה ב-ATP, ובאחרות הגביר את צריכת החמצן בעוד רמת ה-ATP נותרה ללא שינוי או ירדה.
קוראים שרוצים להתחיל בתמונה הרחבה של העברת האלקטרונים יכולים לקרוא כיצד מתילן כחול מעביר אלקטרונים דרך שרשרת הנשימה, וקוראים שרוצים להכיר את המונחים של ניסויי החמצן המוקדמים יכולים לקרוא מה הראו למעשה מדידות הנשימה הראשונות.
נשימה, ATP והמפל שביניהם
אלקטרונים מ-NADH ומ-FADH2 נכנסים לשרשרת בקומפלקסים I ו-II, עוברים דרך קומפלקס III אל ציטוכרום c, ומשם דרך קומפלקס IV אל החמצן. האנרגיה המשתחררת בקומפלקסים I, III ו-IV מניעה שאיבת פרוטונים מהמטריקס אל החלל הבין-ממברנלי. הפרדה זו של מטען וחומציות היא הכוח המניע הפרוטוני, והרכיב החשמלי שלו, פוטנציאל הממברנה, הוא בדרך כלל הרכיב הדומיננטי.
ATP סינתאז מאפשר לפרוטונים לזרום בחזרה אל המטריקס ומשתמש באנרגיה המשתחררת כדי לחבר ADP ופוספט ליצירת ATP. לכן רצף התהליכים הוא:
צריכת חמצן, לאחר מכן שאיבת פרוטונים, לאחר מכן מפל, ולאחר מכן סינתזת ATP.
הבעיה היא שפרוטונים יכולים לחזור גם בדרכים אחרות. כל חזרה שעוקפת את ATP סינתאז היא דליפת פרוטונים. הדליפה מאלצת את השרשרת לשאוב שוב את אותם פרוטונים כדי לשמור על פוטנציאל ממברנה יציב, וכך נצרך יותר חמצן בלי שייווצר יותר ATP. דליפה חזקה מספיק היא ניתוק צימוד: צריכת החמצן עולה בעוד רמת ה-ATP נשארת ללא שינוי או יורדת, והאנרגיה המבוזבזת נפלטת כחום.
מצב 3, מצב 4 ויחס הבקרה הנשימתית
המונחים הקלאסיים לכך מגיעים ממחקרים במיטוכונדריה מבודדות. מצב 3 הוא נשימה בנוכחות סובסטרט ו-ADP: ATP סינתאז מפחית את המפל, פוטנציאל הממברנה יורד, השרשרת מאיצה כדי לבנות אותו מחדש, וצריכת החמצן גבוהה משום שנוצר ATP. מצב 4 הוא נשימה לאחר שה-ADP אוזל: ATP סינתאז אינו פעיל, המפל עולה, פוטנציאל הממברנה הגבוה מקשה על המשך השאיבה, וצריכת החמצן יורדת לרמה הנדרשת כדי לפצות על הדליפה.
יחס הבקרה הנשימתית, מצב 3 חלקי מצב 4, מעיד אפוא על מידת הצימוד בהכנה הניסיונית. יחס גבוה פירושו ש-ADP שולט בנשימה במידה רבה. ירידה ביחס לצד עלייה בנשימה במצב 4 פירושה שהדליפה נעשית דומיננטית. דרך נקודת המבט הזאת אפשר להבין את תוצאות המתילן הכחול שלהלן.
כדאי לזכור מודל מחשבתי אחד. פוטנציאל ממברנה גבוה מאט את השרשרת. פיזור הפוטנציאל מאיץ אותה. השרשרת מגיבה למידת הקושי בשאיבה, ולא ישירות לשאלה אם נוצר ATP.
כאשר מדדי התוצאה משתנים יחד
הדוגמה הברורה ביותר לצימוד מגיעה ממיטוכונדריה מבודדות ממוח של שרקנים, עם קומפלקסים חסומים בשרשרת הנשימה. בריכוזי מתילן כחול של 100 ננומולר עד 1 מיקרומולר, צריכת החמצן במנוחה עלתה כאשר הדלק היה גלוטמט יחד עם מלאט, סוקצינאט או גליצרופוספט, בעוד שהנשימה המגורה באמצעות ADP נותרה ללא שינוי. במיטוכונדריה שבהן קומפלקס I או קומפלקס III הורעל, הצבען הגביר במידה מתונה את ייצור ה-ATP, שיקם את פוטנציאל הממברנה ושיפר את קליטת הסידן. המסלול המוצע הוא קיצור דרך: הצבען מקבל אלקטרונים לפני נקודת החסימה ומעביר אותם לציטוכרום c, תוך עקיפת הקומפלקס הפגוע.
מקרה שני שבו המדדים משתנים יחד משתמש במקור ATP שונה לחלוטין. במיטוכונדריה מבודדות מהמוח שבהן ATP סינתאז עוכב, מתילן כחול עדיין הגביר את הנשימה בכל סובסטרט שנבדק. אבל סינתזת ATP עלתה רק עם אלפא-קטוגלוטרט וגלוטמט, שני הסובסטרטים שיוצרים סוקציניל CoA. כאשר אוליגומיצין חסם את ATP סינתאז, ה-ATP הנוסף נוצר מזרחון ברמת הסובסטרט באמצעות סוקציניל CoA ליגאז במעגל חומצת הלימון, ולא מזרחון חמצוני. הצבען גם שיקם את פוטנציאל הממברנה כאשר קומפלקס I ו-ATP סינתאז עוכבו יחד. כאן צריכת החמצן וה-ATP השתנו יחד, אך רק כאשר הסובסטרט אפשר את מסלול ה-ATP השני. עם סוקצינאט או מלאט, הנשימה עלתה ללא תוספת ATP. אותו צבען, אותו תא מדידה, דלק שונה, תשובה שונה.
כאשר מדדי התוצאה מתפצלים
גם המקרים שבהם המדדים מתפצלים פורסמו, וגם הם מלמדים לא פחות. במחקר משנת 1997 במיטוכונדריה מבודדות מכבד של חולדות, מתילן כחול האיץ נשימה במצב 4 במיטוכונדריה בעלות צימוד הדוק שנשמו באמצעות סוקצינאט, וכך הוריד את יחס הבקרה הנשימתית. ההשפעה נראתה כבר ב-0.5 מיקרומולר והייתה חזקה ב-5 מיקרומולר, ריכוז הקרוב לרמות בפלזמה לאחר הזרקת בולוס תוך-ורידית של 100 מיליגרם. ב-5 מיקרומולר המיטוכונדריה גם התנפחו, אך הפגיעה בצימוד הופיעה תחילה בריכוזים נמוכים יותר. הדבר תומך בכך שהדליפה קדמה לנזק המבני ולא נבעה ממנו. במיטוכונדריה עם צימוד מנותק, הצבען הגביר נשימה באופן תלוי ריכוז המגיע לרוויה. צריכת החמצן עלתה בשתי ההכנות הניסיוניות. סינתזת ATP לכל כמות חמצן שנצרכה לא עלתה. זוהי דוגמה קלאסית לניתוק צימוד לצד העברת אלקטרונים, באותה מולקולה.
הפיצול הבולט ביותר מגיע מהרשתית. בעכברים חסרי AIF ובתאי קולטני אור שטופלו ברוטנון, מתילן כחול שימר את עובי הרשתית, סמנים של קולטני אור ואת מבנה המיטוכונדריה, והפחית את יחס NADH ל-NAD ואת הפעילות של מסלולי עקה, ובהם תגובת החלבונים הלא-מקופלים ומיטופגיה. הוא עשה זאת בלי לתקן את המחסור ב-ATP. הגנה ללא שיקום האנרגיה פירושה שהתועלת נבעה מאיזון חמצון-חיזור ומשמירה על שלמות המיטוכונדריה, ולא מתוספת ATP. מי שישווה בין הישרדות הרקמה לבין שיקום תפוקת האנרגיה יפרש את הניסוי הזה באופן שגוי לחלוטין.
המחקר במיטוכונדריה מהמוח מוסיף צד של עלות לאותה תמונה. אותם ריכוזים נמוכים ששיפרו את הביו-אנרגטיקה גם הגבירו יצירת מי חמצן בכל תנאי שנבדק והאטו את סילוקם. המדידה נעשתה בבדיקת Amplex מכוילת ולא באמצעות צבען לא-ספציפי. יותר ATP ויותר חומר מחמצן הגיעו יחד.
רשימת בדיקה מעשית לקריאה
ארבע שאלות מאפשרות להבחין בין תוצאה מצומדת לתוצאה שאינה מצומדת.
ראשית, איזה מדד תוצאה נמדד בפועל. צריכת חמצן לבדה אינה יכולה להעיד על ATP. סינתזת ATP, פוטנציאל הממברנה ויחס הבקרה הנשימתית מוסיפים כל אחד פיסת מידע שאלקטרודת החמצן אינה יכולה לראות. המדריך לקריאת טענות מחקריות על מתילן כחול מסביר בפירוט את ההקפדה הזאת על מדדי התוצאה.
שנית, איזה סובסטרט הזין את המיטוכונדריה. התוצאה הקשורה לסוקציניל CoA מראה שבחירת הדלק יכולה לקבוע אם תוספת נשימה יכולה בכלל להפוך לתוספת ATP.
שלישית, באיזה ריכוז השתמשו. מתילן כחול בריכוזים ננומולריים עד מיקרומולריים נמוכים במיטוכונדריה מהמוח הניב שיפורים ביו-אנרגטיים מתונים לצד מחיר של חומרים מחמצנים; חצי מיקרומולר ומעלה במיטוכונדריה מהכבד פגע בצימוד; 5 מיקרומולר הוסיפו התנפחות. הריכוז הוא חלק מהמנגנון, לא פרט רקע.
רביעית, באיזה מודל התקבלה התוצאה. מיטוכונדריה מבודדות חושפות את מערכת הקשרים, אך תאים ורקמות שלמים מוסיפים תהליכי הובלה, חיזור לצורה חסרת הצבע ומסלולים מתחרים הקולטים אלקטרונים. מחקרי מינון במעבדה, ובהם בחינת האופן שבו הריכוז והפרוטוקול מעצבים את השפעות המתילן הכחול, הם הגשר בין המספרים בתא המדידה לבין כל טענה הנוגעת לאדם.
צריכת חמצן מעידה על זרימת אלקטרונים. ATP מעיד על כמה מהזרימה הזאת נאגרה. מתילן כחול יכול לשנות כל אחד מהם, והניסויים שלעיל מציגים את כל ארבעת הצירופים הבאים: שניהם עולים, הנשימה עולה ורק כשהסובסטרט מאפשר זאת גם ATP עולה, הנשימה עולה בעוד הצימוד נחלש, והרקמה נשמרת בעוד רמת ה-ATP נותרת ללא שינוי. המספר שמציגה אלקטרודת החמצן הוא תחילת הפרשנות, לא סופה.