אגר EMB לעומת אגר MacConkey: בחירת מצע ופענוח

סטודנט זורע את אותה דגימת מים על שתי צלחות. על אחת מופיעות מושבות כהות בעלות ברק מתכתי ירוק. על האחרת מופיעות מושבות ורודות בוהקות עם הילה עכורה. שתי הצלחות נזרעו מאותו מבחנה, הודגרו זו לצד זו ונקראו באותה שעה. הסטודנט שואל איזו צלחת נכונה.

שתיהן נכונות. הן עונות על שאלות שונות. הבלבול נובע מהתייחסות לשני המצעים כאל בדיקות סינון חלופיות לאותם חיידקי מעיים. יש להם מטרה משותפת: לבחור אורגניזמים אנטריים גראם-שליליים ולהבדיל בין מתסיסי לקטוז ללא-מתסיסים, אך הם מממשים מטרה זו באמצעות כימיה שונה והיגיון חזותי שונה. לאחר שמבינים את שני העקרונות הבסיסיים, בחירת הצלחת ופענוח המושבות נעשים שגרתיים.

התשובה הקצרה

אגר EMB משתמש בשני צבענים, אאוזין Y ומתילן כחול, הממלאים שני תפקידים בו-זמנית: הם מדכאים צמיחה של גראם-חיוביים ושוקעים סביב יצרני חומצה חזקים, וכך יוצרים מושבות כהות, שבמקרה הקלאסי של Escherichia coli מפגינות ברק מתכתי ירוק. אגר MacConkey מפריד בין התפקידים: מלחי מרה יחד עם crystal violet מדכאים גראם-חיוביים, לקטוז משמש מצע לתסיסה, ו-neutral red מצביע על יצירת חומצה באמצעות מושבות ורודות או אדומות. אם המשימה היא הדגמה משוערת ובולטת של E. coli, ל-EMB יש יתרון ברור. אם המשימה היא מיון פשוט של מתסיסי לקטוז ורודים לעומת לא-מתסיסים חסרי צבע, במיוחד בתהליכי עבודה עם צואה או שתן, MacConkey בדרך כלל קל יותר לפענוח. אף אחת מהצלחות אינה מזהה אורגניזם על סמך צבע בלבד.

EMB: צבענים שבוחרים ומדווחים בו-זמנית

העיקרון של EMB משלב סלקציה ואינדיקציה באותן מולקולות. פרוטוקול אגר eosin methylene blue של ASM מתאר את EMB גם כסלקטיבי וגם כדיפרנציאלי, כאשר זוג הצבענים מעכב אורגניזמים גראם-חיוביים רבים, בעוד שתסיסת לקטוז גורמת לקליטת הצבענים ולשקיעתם. פורמולציית Levine תקנית כוללת פפטון, לקטוז, פוספט, אאוזין Y, מתילן כחול ואגר, כפי שמפורט ב-שיטת FDA BAM לאגר Levine EMB. שימו לב שמתכוני EMB ישנים יותר הוסיפו לעיתים סוכרוז לצד לקטוז, בעוד ש-Levine EMB מכיל לקטוז ללא סוכרוז, ולכן יש לתעד איזו פורמולציה מוחזקת במלאי המעבדה שלכם.

פענוח EMB פירושו פענוח התנהגות הצבענים. תסיסת לקטוז נמרצת מייצרת מספיק חומצה כדי לגרום לשקיעה משמעותית של הצבענים, וכך מתקבלים ב-E. coli מרכזים כהים כחול-שחור ובמקרה הקלאסי גם ברק מתכתי ירוק באור מוחזר. מתסיסים חלשים יותר, כגון Enterobacter ו-Klebsiella, גדלים בדרך כלל כמושבות מוקואידיות בגוון ורוד עד סגול ללא הברק הזה. לא-מתסיסים כגון Salmonella, Shigella ו-Proteus גדלים בדרך כלל כמושבות חסרות צבע או שקופות למחצה, משום שאינם מייצרים את פרץ החומצה הגורם לשקיעת הצבענים. גראם-חיוביים מדוכאים בדרך כלל, אם כי עוצמת הדיכוי משתנה בהתאם לזן ולמוצר. הכימיה המלאה של הכנת הצבענים, כולל הסיבה לכך שמתילן כחול מתנהג מלכתחילה כצבען קטיוני, שייכת לדיון נפרד בפורמולציות של צבענים, וההקשר הכללי של מיקרוסקופיה מופיע ב-אטלס לשיטות צביעה. מאמר זה מתמקד בבחירת הצלחות ובפענוחן.

האיור שלמעלה נועד להמחשה. הוא מציג את ההיגיון החזותי הצפוי: מושבות כהות ומבריקות לצד טיפוסים מוקואידיים ורודים וטיפוסים בהירים ב-EMB, לעומת טיפוסים ורודים מול בהירים ב-MacConkey. השתמשו בו כדי ללמוד את הדפוס, ולאחר מכן אשרו כל פענוח מול בקרות מצולמות ועלון המוצר של המצע המדויק הנמצא על שולחן העבודה שלכם.

MacConkey: תפקידים נפרדים, כלל חזותי פשוט יותר

העיקרון של MacConkey מקצה לכל תפקיד מרכיב נפרד. פרוטוקול אגר MacConkey של ASM מציג את אותה מסגרת סלקטיבית ודיפרנציאלית, ו-שיטת FDA BAM לאגר MacConkey מפרטת את המרכיבים הפעילים: פפטונים, לקטוז, מלחי מרה, מלח, neutral red, crystal violet ואגר. מלחי מרה יחד עם crystal violet מבצעים סלקציה נגד גראם-חיוביים. לקטוז מספק את הסובסטרט לתסיסה. Neutral red משמש כמדווח pH, ומשתנה לוורוד עד אדום באזורים שבהם נוצרת חומצה, ולעיתים מופיע גם משקע מרה סביב מתסיסים חזקים.

כלל הפענוח פשוט במכוון: ורוד פירושו מתסיס לקטוז, וחסר צבע או בהיר פירושו לא-מתסיס. E. coli נראה ורוד עד אדום, לעיתים קרובות עם הילה של משקע מרה. Klebsiella ו-Enterobacter נראים ורודים ולעיתים קרובות מוקואידיים בשל הקפסולות שלהם. Salmonella, Shigella, Proteus ומתגים גראם-שליליים רבים אחרים נראים חסרי צבע. יתרון נוסף חשוב במעבדות הוראה: מלחי מרה מפחיתים בדרך כלל את תופעת ה-swarming של Proteus, ולכן קל יותר לקבל מושבות מבודדות על MacConkey מאשר על מצעים לא-סלקטיביים, אם כי הדיכוי אינו מוחלט וקיימות חלופות נטולות מלח כאשר שליטה ב-swarming היא העדיפות.

הסיבה המולקולרית להתנהגות הצבענים הזו קשורה למטען ולמבנה. מתילן כחול הוא צבען phenothiazine קטיוני, ש-המבנה והתכונות שלו מסבירים את הזיקה שלו למשטחים חיידקיים חומציים, אותה זיקה הפועלת כאשר הוא שוקע באזורים חומציים על EMB.

השוואה במבט אחד

יש לקרוא את הטבלה כתהליך קבלת החלטה. כאשר התרגיל דורש מהסטודנטים לראות מדרג של עוצמת תסיסה עם נקודת קצה דרמטית אחת, EMB מציג זאת. כאשר התרגיל דורש מיון בינארי מהיר לפני אימות ביוכימי, MacConkey מציג זאת.

איזה מצע מתאים לאיזו דגימה

בתרגילי מים שמטרתם זיהוי משוער של קוליפורמים צואתיים או E. coli, EMB אטרקטיבי משום שהברק בולט מבחינה חזותית. MacConkey מתאים גם הוא לגראם-שליליים אנטריים ויש לו שימוש היסטורי בבדיקות מים, אך אף אחת מהצלחות אינה תחליף לשיטה רגולטורית לבדיקת מים, שעשויה להגדיר מצעים כגון modified mTEC או MI בהתאם לבדיקה. יש לבדוק איזו שיטה המעבדה שלכם מחויבת לבצע.

להפרדות בסגנון דגימות צואה בין מתסיסים ללא-מתסיסים, MacConkey הוא בדרך כלל השימושי יותר מבין השניים. עבודה מעשית עם דגימות צואה לצורך Salmonella או Shigella כוללת בדרך כלל מצעים אנטריים סלקטיביים יותר, כגון XLD או Hektoen enteric, במקום להסתמך על MacConkey בלבד.

להוראה בסגנון דגימות שתן המדמה תהליך עבודה קליני, שלבו MacConkey עם blood agar. MacConkey מספק את המיון הראשוני של גראם-שליליים, בעוד ש-blood agar מאפשר התאוששות של אורגניזמים ש-MacConkey מדכא. שילוב זה מקובל בתיאורים קליניים של הכנת תרבית שתן.

להוראה ממוקדת עקרונות בלבד, השתמשו בשניהם. EMB מלמד שעוצמת התסיסה חשובה ושמולקולה אחת יכולה למלא שני תפקידים. MacConkey מלמד תכנון מודולרי: גורם הסלקציה, הסובסטרט והמדווח נשמרים נפרדים. סטודנטים שזורעים E. coli ידוע, Klebsiella aerogenes ידוע ו-Salmonella ידוע זה לצד זה על שני המצעים, כמעט שאינם מתבלבלים שוב בין שני העקרונות.

מלכודות פענוח שחוזרות בכל סמסטר

הכשל הנפוץ ביותר הוא זיהוי לפי צבע בלבד. ורוד על MacConkey יכול להיות E. coli, Klebsiella, Enterobacter או מתסיס אחר. חסר צבע יכול להיות Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas או לא-מתסיס אחר. הצבע הוא פנוטיפ סינון המכוון לבדיקות אימות כגון צביעת גראם, אוקסידאז, פאנלים ביוכימיים או זיהוי במכשור, ולא שם של מין.

הכשל השני הוא ייחוס משמעות מוגזמת להיעדר ברק. חלק ממושבות E. coli אמיתיות, במיוחד מושבות מבודדות, מייצרות מעט ברק מתכתי או אינן מייצרות אותו כלל על EMB. היעדר ברק אינו שולל E. coli, ונוכחות ברק אינה מוכיחה אותו. יש להתייחס לברק כרמז משוער.

הכשל השלישי הוא השוואה בין צלחות בגילים שונים. מתסיסי לקטוז מאוחרים יכולים להפוך לוורודים על MacConkey לאחר הדגרה ממושכת, וכך לטשטש את ההפרדה הנקייה בין מתסיסים ללא-מתסיסים. יש לקרוא בזמן שהוגדר על ידי המעבדה ולתעד את משך ההדגרה יחד עם התוצאה.

הכשל הרביעי הוא פענוח של צמיחה מעורבת כאילו מדובר באורגניזם אחד. מושבה ורודה ליד מושבה חסרת צבע מייצגת שני פנוטיפים, ולא מצב ביניים. יש לבחור מושבות מבודדות היטב ולעבוד עם כל מורפוטיפ בנפרד. מרקם מוקואידי יוצר מלכודת דומה: גם Klebsiella וגם Enterobacter יכולים להיראות מוקואידיים, ולכן הקפסולה לבדה לעולם אינה קובעת את השם. האורגניזם שנלמד בעבר כ-Enterobacter aerogenes מסווג כיום כ-Klebsiella aerogenes, מה שמסביר מדוע טבלאות ישנות ותוויות חדשות נראות כסותרות זו את זו.

בקרות וכלל מסכם

הפעילו בכל מפגש בקרות מצולמות או טריות: E. coli עבור תגובת המתסיס החזק, Klebsiella aerogenes עבור תסיסה מוקואידית ללא הברק הקלאסי, זן Salmonella עבור תגובת לא-מתסיס חסרת צבע, ו-Staphylococcus aureus כדי לאשר דיכוי של גראם-חיוביים במוצר המדויק שלכם. התאימו את מספרי הזנים ואת קריטריוני הקבלה לעלון היצרן, משום שהסלקטיביות משתנה בהתאם לתכולת המרה, ה-crystal violet והצבענים.

זכרו משפט אחד ליד שולחן העבודה. EMB משתמש בצבענים שגם בוחרים וגם מדווחים, וכך מתקבל אות דרמטי של E. coli במחיר של פענוח עדין יותר. MacConkey מפריד בין הסלקציה לדיווח, וכך מתקבל מיון פשוט של ורוד לעומת בהיר במחיר של פחות מידע על עוצמת התסיסה. בחרו את המצע שהעיקרון שלו מתאים לשאלה, אשרו את הצבע באמצעות בדיקות מתאימות, ושתי הצלחות יפסיקו להתחרות ויתחילו להשלים זו את זו.