Azul de metileno e ATP: máis consumo de oxíxeno implica máis enerxía?

Unha mitocondria illada está nunha cámara con combustible, pero sen ADP. Consome oxíxeno lentamente. Ao engadir ADP, o consumo de oxíxeno multiplícase varias veces. Ao esperar ata que se esgota o ADP, o consumo de oxíxeno volve baixar. O combustible non cambiou en ningún momento. Só cambiou a demanda de ATP.

Esa pequena secuencia contén toda a distinción da que trata este artigo. O consumo de oxíxeno mide a velocidade á que os electróns flúen pola cadea respiratoria ata o oxíxeno. A produción de ATP mide canto dese fluxo se capta como enerxía utilizable. Ambos comparten un paso intermedio, o gradiente de protóns a través da membrana mitocondrial interna, e calquera cousa que altere o grao de acoplamento entre o gradiente e a síntese de ATP pode facer que os dous parámetros cambien en direccións distintas. O azul de metileno serve para ilustralo porque se observou facendo ambas as cousas: aumentar o consumo de oxíxeno xunto co ATP nalgunhas preparacións e aumentar o consumo de oxíxeno mentres o ATP se mantén estable ou diminúe noutras.

Quen queira primeiro unha visión máis ampla da transferencia de electróns pode comezar por como o azul de metileno transporta electróns pola cadea respiratoria, e quen queira coñecer o vocabulario dos primeiros experimentos con oxíxeno pode ler o que mostraron realmente as primeiras medicións da respiración.

A respiración, o ATP e o gradiente entre ambos

Os electróns do NADH e do FADH2 entran na cadea polos complexos I e II, pasan polo complexo III ata o citocromo c e despois polo complexo IV ata o oxíxeno. A enerxía liberada nos complexos I, III e IV bombea protóns desde a matriz cara ao espazo intermembrana. Esa separación de carga e acidez constitúe a forza protón-motriz, e a súa compoñente eléctrica, o potencial de membrana, adoita ser a dominante.

A ATP sintase permite que os protóns volvan á matriz e utiliza a enerxía liberada para unir ADP e fosfato e formar ATP. Así, a secuencia é:

consumo de oxíxeno, despois bombeo de protóns, despois gradiente e despois síntese de ATP.

O problema é que os protóns poden volver por outras vías. Calquera retorno que non pase pola ATP sintase é unha fuga de protóns. A fuga obriga a cadea a bombear de novo os mesmos protóns para manter estable o potencial de membrana, o que consome máis oxíxeno sen producir máis ATP. Unha fuga suficientemente intensa supón un desacoplamento: o consumo de oxíxeno aumenta mentres o ATP se mantén estable ou diminúe, e a enerxía desaproveitada libérase como calor.

Estado 3, estado 4 e cociente de control respiratorio

O vocabulario clásico para describir isto procede das mitocondrias illadas. O estado 3 é a respiración en presenza de substrato e ADP: a ATP sintase reduce o gradiente, o potencial de membrana baixa, a cadea acelérase para restablecelo e o consumo de oxíxeno é elevado porque se está producindo ATP. O estado 4 é a respiración unha vez esgotado o ADP: a ATP sintase queda inactiva, o gradiente aumenta, o elevado potencial de membrana opón resistencia a un maior bombeo e o consumo de oxíxeno baixa ata o nivel necesario para compensar a fuga.

O cociente de control respiratorio, o estado 3 dividido polo estado 4, indica por tanto o grao de acoplamento da preparación. Un cociente elevado significa que o ADP controla fortemente a respiración. Un cociente que baixa mentres aumenta o estado 4 significa que a fuga está a predominar. Esta é a perspectiva que permite entender os resultados co azul de metileno que se presentan a continuación.

Convén lembrar un modelo mental. Un potencial de membrana elevado frea a cadea. Disipar o potencial aceléraa. A cadea responde á dificultade do bombeo, non directamente a se se está producindo ATP.

Cando os parámetros cambian xuntos

O exemplo máis claro de acoplamento procede de mitocondrias illadas de cerebro de cobaia con complexos respiratorios bloqueados. Con azul de metileno entre 100 nanomolar e 1 micromolar, o consumo de oxíxeno en repouso aumentou usando como combustible glutamato máis malato, succinato ou glicerofosfato, mentres que a respiración estimulada polo ADP non cambiou. Nas mitocondrias co complexo I ou o complexo III inhibido por unha substancia tóxica, o colorante aumentou modestamente a produción de ATP, restableceu o potencial de membrana e mellorou a captación de calcio. A vía proposta é un atallo: o colorante acepta electróns antes do bloqueo e entrégaos ao citocromo c, evitando o complexo danado.

Un segundo caso de acoplamento utiliza unha fonte de ATP completamente distinta. En mitocondrias illadas de cerebro coa ATP sintase inhibida, o azul de metileno seguiu estimulando a respiración con todos os substratos ensaiados. Pero a síntese de ATP só aumentou co alfa-cetoglutarato e co glutamato, os dous substratos que forman succinil CoA. Coa ATP sintase bloqueada pola oligomicina, o ATP adicional procedía da fosforilación a nivel de substrato pola succinil CoA ligase no ciclo do ácido cítrico, non da fosforilación oxidativa. O colorante tamén restableceu o potencial de membrana cando o complexo I e a ATP sintase se inhibiron á vez. Neste caso, o consumo de oxíxeno e o ATP cambiaron xuntos, pero só cando o substrato permitía a segunda vía de produción de ATP. Co succinato ou co malato, a respiración aumentou sen ATP adicional. O mesmo colorante, a mesma cámara, distinto combustible, distinta resposta.

Cando os parámetros diverxen

Os casos de diverxencia tamén están publicados e son igual de instrutivos. Nun estudo de 1997 con mitocondrias illadas de fígado de rata, o azul de metileno acelerou a respiración no estado 4 en mitocondrias ben acopladas que respiraban con succinato, o que reduciu o cociente de control respiratorio. O efecto era visible desde 0.5 micromolar e intenso a 5 micromolar, unha concentración próxima aos niveis plasmáticos tras un bolo intravenoso de 100 miligramos. A 5 micromolar, as mitocondrias tamén se incharon, aínda que o defecto de acoplamento apareceu primeiro a concentracións máis baixas, o que indica que a fuga precedeu o dano estrutural en vez de ser consecuencia del. Nas mitocondrias desacopladas, o colorante estimulou a respiración de forma saturable e dependente da concentración. O consumo de oxíxeno aumentou nas dúas preparacións. A síntese de ATP por unidade de oxíxeno consumido non aumentou. É un exemplo de manual de desacoplamento máis transporte de electróns na mesma molécula.

A separación máis rechamante procede da retina. En ratos deficientes en AIF e células fotorreceptoras tratadas con rotenona, o azul de metileno preservou o grosor da retina, os marcadores dos fotorreceptores e a estrutura mitocondrial, e reduciu o cociente entre NADH e NAD e atenuou as vías de resposta ao estrés, incluídas a resposta ás proteínas non pregadas e a mitofaxia. Fíxoo sen corrixir o déficit de ATP. A protección sen restablecemento da enerxía significa que o beneficio se produciu a través do equilibrio redox e da integridade mitocondrial, non dun aumento do ATP. Quen equiparase a supervivencia do tecido co restablecemento da produción de enerxía interpretaría ese experimento de forma completamente errónea.

O traballo con mitocondrias de cerebro engade unha columna de custos a ese mesmo balance. As mesmas concentracións baixas que melloraron a bioenerxética tamén aumentaron a xeración de peróxido de hidróxeno en todas as condicións ensaiadas e retardaron a súa eliminación, medida cun ensaio Amplex calibrado e non cun colorante inespecífico. Máis ATP e máis oxidante viñeron xuntos.

Unha lista práctica para interpretar os estudos

Catro preguntas permiten distinguir un resultado acoplado dun desacoplado.

Primeira: que parámetro se mediu realmente. O consumo de oxíxeno por si só non informa sobre o ATP. A síntese de ATP, o potencial de membrana e o cociente de control respiratorio achegan, cada un, unha peza que o eléctrodo de oxíxeno non pode detectar. A guía para interpretar as afirmacións da investigación sobre o azul de metileno explica en detalle este rigor na avaliación dos parámetros.

Segunda: que substrato alimentou as mitocondrias. O resultado coa succinil CoA mostra que a elección do combustible pode determinar se a respiración adicional pode chegar a converterse en ATP adicional.

Terceira: que concentración se utilizou. O azul de metileno en concentracións desde nanomolares ata micromolares baixas en mitocondrias de cerebro produciu melloras bioenerxéticas modestas cun custo oxidante; desde medio micromolar en diante, nas mitocondrias de fígado deteriorou o acoplamento; a 5 micromolar engadiu inchazo. A concentración forma parte do mecanismo, non é un detalle secundario.

Cuarta: en que modelo se obtivo o resultado. As mitocondrias illadas revelan as conexións, pero as células e os tecidos intactos engaden o transporte, a redución á forma incolora e os destinos alternativos que compiten polos electróns. Os traballos de dosificación no laboratorio, incluído como a concentración e o protocolo determinan os efectos do azul de metileno, son a ponte entre as cifras da cámara e calquera afirmación sobre unha persoa.

O consumo de oxíxeno informa sobre o fluxo de electróns. O ATP informa sobre canto dese fluxo se captou. O azul de metileno pode modificar calquera dos dous, e os experimentos anteriores mostran as catro combinacións resultantes: ambos aumentan, a respiración aumenta con máis ATP só onde o substrato o permite, a respiración aumenta mentres o acoplamento diminúe e o tecido consérvase mentres o ATP se mantén estable. A cifra do eléctrodo de oxíxeno é o inicio da interpretación, non o final.