Azul de metileno e Bartonella: resultados de laboratorio e límites da evidencia clínica

Unha placa de cultivo e un paciente comparten unha palabra, infección, pero non un concepto. Na placa, a infección é un reconto de colonias en agar. No paciente, son bacterias dentro de células e vasos, fármacos que se desprazan polo sangue e os tecidos, e un sistema inmunitario que fai parte do traballo. Se se confunden ambas as cousas, unha cifra de laboratorio rechamante comeza a parecer un tratamento. Se se manteñen separadas, esa mesma cifra convértese no que é: un motivo para facer o seguinte experimento.

Esa separación é todo o propósito desta revisión sobre o azul de metileno e Bartonella. Dous estudos de laboratorio dun mesmo grupo de investigación ensaiaron o azul de metileno contra Bartonella henselae en estados sen crecemento. Ambos comunicaron unha actividade intensa en vidro e plástico. Ningún o ensaiou nunha persoa.

Por que os investigadores estudan a fase estacionaria

A maioría dos ensaios con antibióticos empregan células en crecemento. Ese modelo deixa fóra un caso máis difícil: células que deixaron de dividirse e toleran fármacos que matan as súas irmás en crecemento.

Bartonella pode persistir no organismo, tamén dentro dos eritrocitos e das células endoteliais. Por iso, o grupo preguntouse que fármacos aprobados poden matar B. henselae despois de entrar na fase estacionaria. Unha MIC baixa contra as células en crecemento non predicía a eliminación das células en fase estacionaria. A rifampicina tiña unha MIC moi baixa, pero eliminaba mal as células estacionarias, mentres que compostos con valores de MIC máis altos as eliminaban ben. Os lectores que queiran un método xeral para abordar este tipo de artigos atoparano na guía para ler investigacións sobre o azul de metileno.

Primeiro cribado: Li e colaboradores, 2019

O cribado de 2019 sobre a fase estacionaria en Antibiotics empregou unha única cepa, B. henselae JK53, cultivada en medio Schneider con 10 por cento de soro fetal bovino a 37 C con 5 por cento de CO2. Os cultivos dun día eran principalmente células dispersas en división. Os cultivos de cinco días, con arredor de 10 elevado á 8 unidades formadoras de colonias por mL, consideráronse en fase estacionaria e contiñan agregados visibles.

O ensaio empregou SYBR Green I con ioduro de propidio, calibrado con mesturas de células vivas e células mortas por isopropanol. Como o azul de metileno ten unha cor intensa, os resultados positivos confirmáronse mediante microscopía e despois con recontos de colonias en agar sangue, o criterio de avaliación máis estrito.

Entre 1,581 fármacos aprobados ensaiados a 50 micromolar, o azul de metileno deixou unha viabilidade do 16 por cento segundo o lector de placas e do 25 por cento segundo a microscopía. A daptomicina rexistrou un 21 por cento; varios azoles, entre o 22 e o 27 por cento; a xentamicina, un 32 por cento; a eritromicina, un 66 por cento; e a ciprofloxacina, un 74 por cento. O pamoato de pirvinio parecía máis potente segundo o lector, pero non se puido avaliar mediante microscopía pola súa propia fluorescencia.

Contra B. henselae en crecemento, a MIC do azul de metileno foi de 0.08 a 0.16 microgramos por mL. Contra células estacionarias de cinco días, a 5 microgramos por mL, o reconto de colonias descendeu ata non detectar ningunha colonia tras un día de exposición, igualando a daptomicina e o pamoato de pirvinio nas concentracións ensaiadas. Un ensaio separado de eliminación ao longo do tempo empregou 10 microgramos por mL. Eses son niveis de exposición de laboratorio, non doses, e o artigo preséntaos como tales. Un valor citado de concentración plasmática máxima en humanos próximo a 3.9 microgramos por mL aparece no artigo só como contexto. A visión xeral da farmacocinética do azul de metileno explica por que unha cifra plasmática non se pode interpretar como unha cifra nos tecidos.

O artigo explicita dous límites. Non houbo un modelo de biopelícula nin ensaios de combinacións con azul de metileno. Os agregados de cinco días eran agrupacións nun cultivo líquido en fase estacionaria, non un experimento validado de biopelícula. Os autores pediron estudos en animais, con combinacións, con biopelículas e noutras especies de Bartonella.

Combinacións e células procedentes de biopelículas: Zheng e colaboradores, 2020

O estudo de seguimento de 2020 en BMC Microbiology mantivo a mesma cepa e o mesmo medio, pero pasou a cultivos estacionarios de seis días e engadiu dúas cousas que faltaban no primeiro artigo: combinacións de dous fármacos e un modelo de células procedentes de biopelículas.

Para os fármacos individuais, cunha concentración uniforme de 5 microgramos por mL durante 24 horas, o azul de metileno deixou 3.2 por 10 elevado á 4 unidades formadoras de colonias por mL, fronte a un control próximo a 2.8 por 10 elevado á 10. A ciprofloxacina, a xentamicina e a nitrofurantoína deixaron menos colonias nese mesmo punto. Isto difire do resultado de 2019, no que o mesmo nivel nominal non deixou colonias detectables tras un día. A idade, a densidade e a manipulación dos cultivos eran distintas, polo que a eliminación foi reproducible na súa tendencia, pero non idéntica na súa magnitude. Esta variación entre ensaios é un dos motivos polos que as comprobacións habituais de seguridade e interaccións tratan a potencia de laboratorio como algo distinto do efecto clínico.

O cribado de combinacións é a parte máis citada. Cada compoñente fixouse en 5 microgramos por mL. Tanto a azitromicina máis azul de metileno como a rifampicina máis azul de metileno non deixaron colonias detectables en fase estacionaria ás 24 horas, ao igual que as dúas parellas con ciprofloxacina, e só esas catro entre as 25 parellas ensaiadas. Non se fixo unha análise formal de sinerxía, polo que o termo correcto é combinación activa nestas condicións, non sinerxía demostrada.

O experimento de biopelícula ensaiou células recuperadas dunha biopelícula nova desestruturada, non a penetración nunha biopelícula madura intacta. Os cultivos cultiváronse durante cinco días, diluíronse en placas de pocillos durante outros cinco días, confirmáronse mediante tinguidura con violeta de cristal e despois raspáronse antes da exposición aos fármacos. A 5 microgramos por mL, o reconto co azul de metileno só descendeu a 2.3 por 10 elevado á 2 no día 6, entre os mellores fármacos individuais, pero non a cero. As dúas combinacións con azul de metileno chegaron a cero no día 6, ao igual que as dúas combinacións con ciprofloxacina.

Os autores sinalaron os mesmos límites que detectaría un lector atento: unha biopelícula nova raspada en lugar dunha antiga intacta, unha concentración práctica para todos os fármacos en vez de cada fármaco na súa propia concentración máxima realista, só parellas seleccionadas centradas na azitromicina ou na rifampicina, unha cepa, ningún animal e ningún paciente. Propuxéronse estudos posteriores con tres fármacos, pero non se presentaron resultados.

Comparación do deseño dos estudos

A táboa resume o argumento deste artigo. Todo o que queda á esquerda da última columna é traballo con cultivos. Nada de ningún dos dous artigos ocupa a última columna.

Bartonella non é Borrelia

Ambos os artigos mencionan Borrelia burgdorferi, a espiroqueta da enfermidade de Lyme, porque o ensaio con colorantes procedía de traballos anteriores sobre Borrelia en fase estacionaria no mesmo laboratorio, nos que o azul de metileno e a daptomicina tamén deran resultados positivos. Esa historia é un contexto útil e unha fonte frecuente de erros.

Ningún experimento de ningún dos dous artigos sobre Bartonella ensaia Borrelia e Bartonella en paralelo. Os organismos difiren, os medios difiren, as concentracións difiren, e o hipotético efecto do azul de metileno sobre a membrana de Bartonella presentouse como unha especulación que precisa máis estudo. Os resultados non se deben extrapolar entre especies, e ningún dos dous artigos apoia afirmacións xerais sobre parasitos. A comparación das células persistentes de Borrelia e Bartonella mantén separadas ambas as bibliografías por este motivo.

Por que os cultivos non se converten nun protocolo

É comprensible o interese nas buscas dun protocolo de azul de metileno para Bartonella. Estes artigos son o motivo polo que esa expresión se debe tratar como un sinal de advertencia e non como unha lista da compra.

Primeiro, 5 microgramos por mL nun pocillo non é unha prescrición. Non leva asociados datos de absorción, distribución, unión a proteínas, penetración intracelular nin tolerabilidade. Os autores escollérono como unha media aproximada das concentracións máximas dos antibióticos e indicaron que os traballos futuros deberían empregar cada fármaco no seu propio nivel realista.

Segundo, cero colonias significa que non hai colonias nesas condicións de sementeira en placa, non que o tecido sexa estéril. As células persistentes, as bacterias intracelulares e os límites da mostraxe quedan todos fóra da placa de agar.

Terceiro, as combinacións que esterilizan un pocillo poden fracasar ou causar dano nun organismo. A azitromicina máis azul de metileno e a rifampicina máis azul de metileno son parellas de laboratorio con exposicións de laboratorio. Sen farmacocinética en animais e datos controlados en humanos, non hai dose, nin duración, nin relación beneficio-risco. Calquera persoa que estea a valorar opcións debería comentalas cun profesional médico e revisar cando o uso de azul de metileno precisa supervisión médica antes de extraer conclusións dos datos dunha placa.

A conclusión limitada que si apoian estes artigos é esta: o azul de metileno ten unha actividade reproducible contra B. henselae JK53 sen crecemento in vitro, tamén en combinacións de dous fármacos no laboratorio, e os resultados máis destacados en combinacións e células procedentes de biopelículas proveñen do estudo de 2020. Todo o demais, incluído se esa actividade é relevante para a bartonelose humana, segue sen ensaiarse.