Ágar EMB fronte ao ágar MacConkey: selección e interpretación dos medios

Un estudante sementa por esgotamento a mesma mostra de auga en dúas placas. Nunha aparecen colonias escuras cun brillo metálico verde. Na outra aparecen colonias de cor rosa intensa cun halo difuso. Ambas as placas foron inoculadas a partir do mesmo tubo, incubadas unha ao lado da outra e lidas á mesma hora. O estudante pregunta cal das placas é a correcta.

As dúas son correctas. Responden a preguntas diferentes. A confusión xorde de tratar os dous medios como probas intercambiables para bacterias intestinais. Comparten un propósito, que é seleccionar organismos entéricos Gram negativos e separar os fermentadores de lactosa dos non fermentadores, pero cumpren ese propósito mediante unha química distinta e unha lóxica visual diferente. Unha vez comprendidos os dous conceptos subxacentes, a selección da placa e a lectura das colonias convértense en tarefas rutineiras.

A resposta curta

O ágar EMB utiliza dous colorantes, eosina Y e azul de metileno, que cumpren unha dobre función: inhiben o crecemento de Gram positivos e precipitan arredor dos produtores intensos de ácido para formar colonias escuras, clásicamente cun brillo metálico verde no caso de Escherichia coli. O ágar MacConkey separa as funcións: as sales biliares xunto co violeta cristal inhiben os Gram positivos, a lactosa serve de substrato para a fermentación e o vermello neutro revela o ácido mediante colonias rosas ou vermellas. Se a tarefa consiste nunha demostración presuntiva visualmente marcada de E. coli, EMB ten unha función clara. Se a tarefa consiste en separar de maneira sinxela fermentadores de lactosa rosas de non fermentadores incoloros, especialmente en fluxos de traballo con feces ou ouriños, MacConkey adoita ser máis doado de interpretar. Ningunha das dúas placas identifica un organismo só pola cor.

EMB: colorantes que seleccionan e indican ao mesmo tempo

O concepto de EMB concentra a selección e a indicación nas mesmas moléculas. O protocolo de ágar eosina-azul de metileno da ASM describe EMB como un medio tanto selectivo como diferencial, no que o par de colorantes inhibe moitos organismos Gram positivos mentres que a fermentación da lactosa provoca a captación e precipitación dos colorantes. Unha formulación estándar de Levine contén peptona, lactosa, fosfato, eosina Y, azul de metileno e ágar, tal como se indica no método BAM da FDA para ágar EMB de Levine. Cómpre ter en conta que algunhas receitas antigas de EMB engadían sacarosa xunto coa lactosa, mentres que o EMB de Levine contén lactosa sen sacarosa, polo que convén rexistrar que formulación utiliza o laboratorio.

Interpretar EMB significa interpretar o comportamento dos colorantes. Unha fermentación intensa da lactosa produce ácido suficiente para provocar unha forte precipitación dos colorantes, o que dá a E. coli centros azul escuro a negros e, no caso clásico, un brillo metálico verde baixo luz reflectida. Os fermentadores máis débiles, como Enterobacter e Klebsiella, adoitan crecer formando colonias mucoides de rosa a púrpura sen ese brillo. Os non fermentadores, como Salmonella, Shigella e Proteus, normalmente medran como colonias incoloras ou translúcidas porque non producen o pulso de ácido que precipita os colorantes. Os Gram positivos adoitan quedar inhibidos, aínda que o grao de inhibición varía segundo a cepa e o produto. A química completa da preparación dos colorantes, incluído o motivo polo que o azul de metileno se comporta en primeiro lugar como un colorante catiónico, pertence a unha explicación específica sobre formulacións de colorantes, e o contexto xeral de microscopía recóllese nun atlas de métodos de tinguidura. Este artigo céntrase na selección e na lectura das placas.

A figura anterior é ilustrativa. Mostra a lóxica visual que se pode esperar: colonias escuras con brillo, tipos mucoides rosas e tipos pálidos en EMB, fronte a tipos rosas e pálidos en MacConkey. Utilízaa para aprender o patrón e, despois, confirma cada interpretación con controis fotografados e coas instrucións do produto correspondente ao medio exacto que haxa no banco de laboratorio.

MacConkey: funcións separadas, regra visual máis simple

O concepto de MacConkey asigna cada función a un ingrediente distinto. O protocolo de ágar MacConkey da ASM presenta o mesmo enfoque selectivo e diferencial, e o método BAM da FDA para ágar MacConkey enumera os seus compoñentes funcionais: peptonas, lactosa, sales biliares, sal, vermello neutro, violeta cristal e ágar. As sales biliares xunto co violeta cristal seleccionan contra os Gram positivos. A lactosa fornece o substrato de fermentación. O vermello neutro actúa como indicador de pH e vira de rosa a vermello onde se forma ácido, ás veces con bilis precipitada arredor dos fermentadores intensos.

A regra de lectura é deliberadamente sinxela: rosa significa fermentador de lactosa; incoloro ou pálido significa non fermentador. E. coli aparece de rosa a vermello, a miúdo cun halo de precipitado biliar. Klebsiella e Enterobacter aparecen rosas e con frecuencia mucoides debido ás súas cápsulas. Salmonella, Shigella, Proteus e moitos outros bacilos Gram negativos aparecen incoloros. Hai ademais unha vantaxe relevante nos laboratorios docentes: as sales biliares adoitan reducir o swarming de Proteus, polo que resulta máis doado obter colonias illadas en MacConkey que en medios non selectivos, aínda que a inhibición non é absoluta e existen alternativas sen sal cando o control do swarming é a prioridade.

A razón molecular pola que os colorantes se comportan deste xeito está relacionada coa carga e coa estrutura. O azul de metileno é un colorante catiónico de fenotiazina cuxa estrutura e propiedades explican a súa afinidade polas superficies bacterianas ácidas, a mesma afinidade que intervén cando precipita nas zonas ácidas do EMB.

Comparación rápida

Le a táboa como un procedemento de decisión. Cando o exercicio require que os estudantes vexan un gradiente na intensidade da fermentación cun punto final moi marcado, EMB móstrao. Cando o exercicio require unha clasificación binaria rápida antes da confirmación bioquímica, MacConkey móstraa.

Que medio utilizar para cada mostra

Para exercicios con auga destinados ao recoñecemento presuntivo de coliformes fecais ou E. coli, EMB resulta atractivo porque o brillo é visualmente distintivo. MacConkey tamén permite traballar con Gram negativos entéricos e utilizouse historicamente con auga, pero ningunha das dúas placas substitúe un método regulamentario para análise de auga, que pode especificar medios como mTEC modificado ou MI segundo a proba. Consulta o método que o teu laboratorio estea obrigado a seguir.

Para separacións de tipo fecal entre fermentadores e non fermentadores, MacConkey adoita ser o máis útil dos dous. O traballo práctico con mostras fecais para Salmonella ou Shigella normalmente incorpora medios entéricos máis selectivos, como XLD ou Hektoen enteric, en lugar de depender só de MacConkey.

Para prácticas docentes con ouriños que imiten o fluxo de traballo clínico, combina MacConkey con ágar sangue. MacConkey proporciona unha separación inicial dos Gram negativos, mentres que o ágar sangue permite recuperar organismos que MacConkey inhibe. Esta combinación é habitual nas descricións clínicas da preparación de cultivos de ouriños.

Para ensinar os conceptos de maneira directa, utiliza ambos. EMB ensina que a intensidade da fermentación importa e que unha mesma molécula pode cumprir dúas funcións. MacConkey ensina un deseño modular: selector, substrato e indicador mantéñense separados. Os estudantes que sementan lado a lado unha E. coli coñecida, unha Klebsiella aerogenes coñecida e unha Salmonella coñecida nos dous medios raramente volven confundir ambas as lóxicas.

Erros de lectura que se repiten cada curso

O erro máis común é identificar pola cor unicamente. Unha colonia rosa en MacConkey pode ser E. coli, Klebsiella, Enterobacter ou outro fermentador. Unha colonia incolora pode ser Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas ou outro non fermentador. A cor é un fenotipo de cribado que orienta o traballo de confirmación, como a tinguidura de Gram, a oxidase, os paneis bioquímicos ou a identificación instrumental, non o nome dunha especie.

O segundo erro é dar demasiada importancia á ausencia de brillo. Algunhas colonias reais de E. coli, especialmente as illadas, producen pouco ou ningún brillo metálico en EMB. A ausencia de brillo non exclúe E. coli, e a súa presenza non a confirma. Considera o brillo unha pista presuntiva.

O terceiro erro é comparar placas de distintas idades. Os fermentadores tardíos de lactosa poden virar a rosa en MacConkey tras unha incubación prolongada, o que difumina a separación clara entre fermentadores e non fermentadores. Fai a lectura á hora especificada polo laboratorio e rexistra o tempo de incubación xunto co resultado.

O cuarto erro é interpretar un crecemento mixto como un único organismo. Unha colonia rosa xunto a unha incolora representa dous fenotipos, non un estado intermedio. Escolle colonias ben illadas e traballa cada morfotipo por separado. A textura mucoide crea unha trampa semellante: tanto Klebsiella como Enterobacter poden ter aspecto mucoide, polo que a cápsula por si soa nunca determina a identificación. O organismo que antes se ensinaba como Enterobacter aerogenes clasifícase agora como Klebsiella aerogenes, o que explica por que as táboas antigas e as etiquetas máis recentes poden parecer contraditorias.

Controis e unha regra final

Utiliza controis fotografados ou frescos en cada sesión: E. coli para a reacción de fermentación intensa, Klebsiella aerogenes para a fermentación mucoide sen o brillo clásico, unha cepa de Salmonella para a reacción incolora de non fermentación e Staphylococcus aureus para confirmar a inhibición dos Gram positivos no produto exacto utilizado. Axusta os números de cepa e os criterios de aceptación ás instrucións do fabricante, porque a selectividade cambia segundo o contido en bilis, violeta cristal e colorantes.

Lembra unha frase no banco de laboratorio. EMB utiliza colorantes que seleccionan e indican ao mesmo tempo, o que proporciona un sinal visual marcado de E. coli a cambio dunha lectura máis sutil. MacConkey separa a selección da indicación, o que proporciona unha clasificación simple entre rosa e pálido a cambio de ofrecer menos detalle sobre a fermentación. Escolle o medio cuxo concepto corresponda coa pregunta, confirma a cor mediante as probas axeitadas e as dúas placas deixarán de competir para empezar a complementarse.