Bleu de méthylène et Bartonella : résultats de laboratoire et limites des données cliniques

Une boîte de culture et un patient ont un mot en commun, infection, mais pas un concept. Dans la boîte, l’infection correspond à un nombre de colonies sur gélose. Chez le patient, ce sont des bactéries à l’intérieur des cellules et des vaisseaux, des médicaments qui circulent dans le sang et les tissus, et un système immunitaire qui accomplit une partie du travail. Confondre les deux fait rapidement ressembler un résultat de laboratoire frappant à un traitement. Les distinguer permet de voir ce même résultat pour ce qu’il est : une raison de mener l’expérience suivante.

Cette distinction constitue tout l’enjeu de cette revue sur le bleu de méthylène et Bartonella. Deux études de laboratoire menées par un même groupe de recherche ont testé le bleu de méthylène contre Bartonella henselae dans des états non prolifératifs. Toutes deux ont rapporté une forte activité dans des dispositifs de laboratoire en verre et en plastique. Aucune n’a testé le produit chez une personne.

Pourquoi les chercheurs testent la phase stationnaire

La plupart des tests d’antibiotiques utilisent des cellules en croissance. Ce modèle ne couvre pas un cas plus difficile : des cellules qui ont cessé de se diviser et tolèrent des médicaments qui tuent leurs homologues en croissance.

Bartonella peut persister dans l’organisme, notamment à l’intérieur des érythrocytes et des cellules endothéliales. Le groupe a donc cherché à déterminer quels médicaments approuvés pouvaient tuer B. henselae après son entrée en phase stationnaire. Une faible MIC contre les cellules en croissance ne prédisait pas l’élimination des cellules en phase stationnaire. La rifampicine présentait une MIC très faible, mais éliminait mal les cellules stationnaires, tandis que des composés ayant des valeurs de MIC plus élevées les éliminaient efficacement. Les lecteurs qui souhaitent une méthode générale pour aborder ce type d’article la trouveront dans le guide de lecture des recherches sur le bleu de méthylène.

Premier dépistage : Li et ses collègues, 2019

Le dépistage de 2019 sur la phase stationnaire dans Antibiotics a utilisé une seule souche, B. henselae JK53, cultivée dans un milieu de Schneider avec 10 percent de sérum bovin fœtal à 37 C avec 5 percent CO2. Les cultures d’un jour étaient principalement constituées de cellules en division dispersées. Les cultures de cinq jours, à environ 10 to the 8th unités formant colonie per mL, ont été considérées comme étant en phase stationnaire et contenaient des agrégats visibles.

Le test utilisait SYBR Green I avec de l’iodure de propidium, étalonné sur des mélanges de cellules vivantes et de cellules tuées à l’isopropanol. Comme le bleu de méthylène est fortement coloré, les résultats positifs ont été confirmés par microscopie, puis par comptage des colonies sur gélose au sang, un critère plus strict.

Parmi 1,581 médicaments approuvés testés à 50 micromolar, le bleu de méthylène laissait 16 percent de viabilité selon le lecteur de plaque et 25 percent selon la microscopie. La daptomycine atteignait 21 percent, plusieurs azolés 22 à 27 percent, la gentamicine 32 percent, l’érythromycine 66 percent et la ciprofloxacine 74 percent. Le pamoate de pyrvinium semblait plus actif selon le lecteur, mais ne pouvait pas être évalué par microscopie en raison de sa propre fluorescence.

Contre B. henselae en croissance, la MIC du bleu de méthylène était de 0.08 à 0.16 micrograms per mL. Contre des cellules stationnaires de cinq jours à 5 micrograms per mL, le comptage des colonies est tombé à aucune colonie détectable après un jour d’exposition, comme pour la daptomycine et le pamoate de pyrvinium aux concentrations testées. Une expérience distincte de cinétique d’élimination utilisait 10 micrograms per mL. Il s’agit de niveaux d’exposition en laboratoire, et non de doses, et l’article les présente comme tels. Une valeur maximale de concentration plasmatique humaine citée, proche de 3.9 micrograms per mL, n’apparaît dans l’article qu’à titre de contexte général. La présentation de la pharmacocinétique du bleu de méthylène explique pourquoi une valeur plasmatique ne peut pas être interprétée comme une valeur tissulaire.

Deux limites sont explicitement indiquées dans l’article. Il n’y avait ni modèle de biofilm ni test d’association avec le bleu de méthylène. Les agrégats de cinq jours étaient des amas dans une culture liquide en phase stationnaire, et non une expérience validée sur le biofilm. Les auteurs ont appelé à mener des travaux chez l’animal, des travaux sur les associations, des travaux sur les biofilms et des tests sur d’autres espèces de Bartonella.

Associations et cellules issues de biofilm : Zheng et ses collègues, 2020

Le suivi de 2020 dans BMC Microbiology a conservé la même souche et le même milieu, mais est passé à des cultures stationnaires de six jours et a ajouté deux éléments absents du premier article : des associations de deux médicaments et un modèle de cellules issues de biofilm.

Pour les médicaments seuls à une concentration uniforme de 5 micrograms per mL pendant 24 heures, le bleu de méthylène laissait 3.2 times 10 to the 4th unités formant colonie per mL contre un témoin proche de 2.8 times 10 to the 10th. La ciprofloxacine, la gentamicine et la nitrofurantoïne laissaient moins de colonies au même point. Cela diffère du résultat de 2019, où le même niveau nominal ne donnait aucune colonie détectable après un jour. L’âge de la culture, sa densité et sa manipulation différaient ; l’effet d’élimination était donc reproductible dans son orientation, mais pas identique dans son ampleur. Cette variation d’une expérience à l’autre est l’une des raisons pour lesquelles les contrôles standards de sécurité et d’interactions considèrent la puissance en laboratoire comme distincte de l’effet clinique.

Le dépistage des associations est la partie la plus souvent citée. Chaque composant était fixé à 5 micrograms per mL. L’azithromycine plus le bleu de méthylène et la rifampicine plus le bleu de méthylène ne donnaient aucune colonie détectable en phase stationnaire à 24 heures, tout comme les deux associations contenant de la ciprofloxacine ; seules ces quatre associations parmi les 25 paires testées obtenaient ce résultat. Aucune analyse formelle de synergie n’a été réalisée ; le terme correct est donc association active dans ces conditions, et non synergie démontrée.

L’expérience sur le biofilm a testé des cellules récupérées à partir d’un jeune biofilm désagrégé, et non la pénétration dans un biofilm mature intact. Les cultures ont été développées pendant cinq jours, diluées dans des plaques à puits pendant cinq jours supplémentaires, confirmées par coloration au cristal violet, puis raclées avant l’exposition au médicament. À 5 micrograms per mL, le bleu de méthylène seul est descendu à 2.3 times 10 to the 2nd au jour 6, parmi les meilleurs agents seuls, mais pas à zéro. Les deux associations contenant du bleu de méthylène ont atteint zéro au jour 6, tout comme les deux associations contenant de la ciprofloxacine.

Les auteurs ont signalé les mêmes limites qu’un lecteur attentif relèverait : un jeune biofilm raclé plutôt qu’un ancien biofilm intact, une concentration unique choisie par commodité pour tous les médicaments au lieu d’utiliser pour chacun son propre pic réaliste, uniquement certaines associations centrées sur l’azithromycine ou la rifampicine, une seule souche, aucun animal et aucun patient. Des travaux ultérieurs sur des associations de trois médicaments ont été proposés, mais pas rapportés.

Comparaison des plans d’étude

Le tableau résume l’essentiel de cet article. Tout ce qui se trouve à gauche de la dernière colonne relève de travaux sur cultures. Aucun élément de l’un ou l’autre article n’occupe la dernière colonne.

Bartonella n’est pas Borrelia

Les deux articles mentionnent Borrelia burgdorferi, le spirochète responsable de la maladie de Lyme, parce que le test utilisant le colorant provenait de travaux antérieurs du même laboratoire sur Borrelia en phase stationnaire, dans lesquels le bleu de méthylène et la daptomycine avaient également été identifiés comme actifs. Cet historique constitue un contexte utile et une source fréquente d’erreur.

Aucune expérience dans l’un ou l’autre article sur Bartonella ne teste Borrelia côte à côte avec Bartonella. Les organismes diffèrent, les milieux diffèrent, les concentrations diffèrent, et l’effet hypothétique du bleu de méthylène sur les membranes de Bartonella a été présenté comme une spéculation nécessitant des recherches supplémentaires. Les résultats ne doivent pas être transposés d’une espèce à l’autre, et aucun des deux articles ne soutient des affirmations générales concernant les parasites. La comparaison des formes persistantes de Borrelia et de Bartonella maintient ces deux corpus de recherche séparés pour cette raison.

Pourquoi les cultures ne se transforment pas en protocole

L’intérêt suscité dans les recherches par un protocole bartonella au bleu de méthylène est compréhensible. Ces articles expliquent pourquoi cette expression doit être considérée comme un signal d’avertissement plutôt que comme une liste d’achats.

Premièrement, 5 micrograms per mL dans un puits n’est pas une prescription. Cette valeur ne tient pas compte de l’absorption, de la distribution, de la liaison aux protéines, de la pénétration intracellulaire ni de la tolérabilité. Les auteurs l’ont choisie comme moyenne approximative des concentrations maximales d’antibiotiques et ont indiqué que les travaux futurs devraient utiliser pour chaque médicament son propre niveau réaliste.

Deuxièmement, zéro colonie signifie aucune colonie dans ces conditions de mise en culture, et non un tissu stérile. Les formes persistantes, les bactéries intracellulaires et les limites d’échantillonnage se situent toutes en dehors de la boîte de gélose.

Troisièmement, des associations qui stérilisent un puits peuvent échouer ou être nocives dans un organisme. L’azithromycine plus le bleu de méthylène et la rifampicine plus le bleu de méthylène sont des associations de laboratoire à des niveaux d’exposition de laboratoire. Sans pharmacocinétique animale ni données humaines contrôlées, il n’existe ni dose, ni durée, ni rapport bénéfice-risque établi. Toute personne évaluant des options devrait en discuter avec un clinicien et examiner les situations dans lesquelles l’utilisation du bleu de méthylène nécessite une supervision médicale avant de tirer une quelconque conclusion à partir de données obtenues en boîte de culture.

La conclusion limitée que ces articles permettent effectivement de tirer est la suivante : le bleu de méthylène présente une activité reproductible in vitro contre B. henselae JK53 non proliférante, notamment dans des associations de deux médicaments testées en laboratoire, les résultats les plus marqués pour les associations et les cellules issues de biofilm provenant de l’étude de 2020. Tout le reste, y compris la question de savoir si cette activité a une pertinence pour la bartonellose humaine, reste non testé. :::