Artikkeli
Maidon metyleenisinisen pelkistystesti: periaate ja rajoitukset
Opiskelija nostaa esiin kaksi maitoa sisältävää koeputkea. Toinen muuttui valkoiseksi tunnissa. Toinen pysyi sinisenä viisi tuntia. Hän osoittaa sinistä putkea ja sanoo, että maito on turvallista juoda.
Tämä johtopäätös paljastaa virheellisen käsityksen testistä. Maidon metyleenisininen-testi ei osoita turvallisuutta. Se kertoo, kuinka nopeasti putken mikrobipopulaatio alentaa hapetus-pelkistyspotentiaalia vakioiduissa olosuhteissa. Hidas tulos tarkoittaa näytteen vähäistä kokonaisaineenvaihdunta-aktiivisuutta. Se ei kerro, mitä mikrobeja näytteessä on, onko niiden joukossa taudinaiheuttajia tai onko maito pastöroitu oikein.
Erottelu on tärkeä, koska testi näyttää vakuuttavalta. Sininen väri katoaa. Kello antaa lukeman. Lukemat houkuttelevat ylitulkintaan. Tässä artikkelissa säilytetään hyödyllinen tulkinta ja suljetaan pois vaarallinen.
Mitä pelkistyminen oikeastaan mittaa
Metyleenisininen on hapettuneena sinistä ja leukometyleenisiniseksi pelkistyneenä lähes väritöntä. Tuore maito sisältää liuennutta happea, joka pitää väriaineen sinisenä. Hengittävät ja fermentoivat bakteerit kuluttavat tätä happea ja vapauttavat pelkistäviä yhdisteitä. Kun hapetus-pelkistyspotentiaali laskee riittävän alas, väriaine vastaanottaa elektroneja ja menettää värinsä. Guelphin yliopiston maitomikrobiologian oppimateriaali kuvaa saman tapahtumasarjan: ensin happi poistuu, ja sitten bakteerien aineenvaihdunnassa muodostuu pelkistäviä aineita.
Journal of Dairy Science -lehdessä julkaistu klassinen tutkimus kuvaa tätä kaksivaiheisena prosessina: mikrobisto kuluttaa ensin hapen loppuun, minkä jälkeen maidon ainesosat pelkistävät väriaineen nopeasti. Siksi maidon metyleenisinisen pelkistystesti on parasta ymmärtää yhteisen aineenvaihdunta-aktiivisuuden toiminnallisena määrityksenä, ei solulaskurina. Metyleenisinisen redox-käyttäytyminen selittää tämän muutoksen taustalla olevan kemian.
Happi kumoaa päätepisteessä havaitun muutoksen. Ilmalle altistunut pelkistynyt leukoväriaine hapettuu uudelleen ja muuttuu jälleen siniseksi. Ravistaminen, kaataminen, leveät putket ja suuri kaasutila viivästyttävät siksi tulosta. Ohut sininen rengas jää usein ilman ja nesteen rajapintaan sen jälkeen, kun muu putken sisältö on menettänyt sinisen värinsä. Standardimenetelmät hyväksyvät tämän renkaan eivätkä edellytä sen häviämisen odottamista.
Mikrobityyppi tuo mukaan toisen vääristymän. Koliformit ja monet maitohappomikrobit pelkistävät väriaineen nopeasti. Monet psykrotrofiset ja lämpöä kestävät mikrobit pelkistävät sitä hitaasti tai tuskin lainkaan. Kaksi maitonäytettä, joilla on sama pesäkemäärä maljalla, voivat menettää sinisen värinsä tuntien erolla. Jo tämä sulkee pois ajan muuntamisen pesäkemääräksi.
Kontrolloitu laboratoriomenetelmä
Kenttämenetelmät ja oppikirjoissa esitetyt menetelmät eroavat yksityiskohdiltaan, joten tulos on pätevä vain sen tuottaneen menetelmän puitteissa. Tavanomainen elintarvikelaboratorion menetelmä etenee seuraavasti:
- Ota raakamaitonäyte niin, että siihen sekoittuu mahdollisimman vähän ilmaa, ja jäähdytä se viipymättä. Sekoita kääntelemällä varovasti ennen osanäytteen ottamista.
- Annostele steriiliin putkeen 10 mL maitoa ja 1 mL väriaineen käyttöliuosta. Yksi yleisesti käytetty käyttöliuoksen pitoisuus on 0.005 prosenttia väriainetta, ja maidon ja väriaineen suhde on 10 suhteessa 1:een.
- Sulje putki tulpalla, käännä se varovasti ylösalaisin kahdesti ja siirrä vesihauteeseen muutaman minuutin kuluessa. Tyypillinen inkubointilämpötila on 35–38 celsiusastetta käytettävän standardin mukaan. Kirjaa, mitä standardia noudatat.
- Suojaa putket valolta inkuboinnin aikana, sillä valo nopeuttaa pelkistymistä.
- Tarkasta tulos 30 minuutin kohdalla ja sen jälkeen vakioiduin väliajoin. Päätepiste on ajankohta, jolloin putken väri vastaa keitettyä maitoa sisältävää vertailunäytettä tai saavuttaa menetelmässä määritellyn värin häviämisen.
- Säilytä samasta maidosta käsittelemätön putki visuaalisena kontrollina, jos menetelmä sitä edellyttää.
FAO:n maidon testausoppaassa esitetään tästä tapahtumasarjasta yksityiskohtainen kenttäversio: 10 mL maitoa ja 1 mL väriainetta, putken sulkeminen tulpalla, varovainen kääntely, inkubointi noin 37–38 asteessa ja tulosten tarkastus 30 minuutin välein. Sen kontrolliputkissa käytetään keitettyä maitoa luonnollisen pelkistysjärjestelmän tuhoamiseksi ja värivertailun vertailukohdan määrittämiseksi.
Yllä oleva kaavio määrittää kontrolloitavat tekijät. Samat tilavuudet, sama väriaine, sama lämpötila, sama sekoitus, sama valosuojaus ja sama päätepisteen määrittely. Jos muutat yhtäkin niistä, myös mitattu aika muuttuu. Siksi kotiversiot, joissa käytetään mielivaltaista väriainepitoisuutta, eivät ole vertailukelpoisia laboratorion laatuluokitusten kanssa.
Mitä pelkistymisaika kertoo
Pidempi aika tarkoittaa vähäisempää kokonaisaktiivisuutta ilmoitetuissa olosuhteissa. Lyhyempi aika tarkoittaa suurempaa kokonaisaktiivisuutta. Maitotalouden opetuksessa käytettävät taulukot liittävät näihin aikoihin karkeita laatuluokkia. Esimerkiksi yhdessä BIS-pohjaisessa luokituksessa 5 tuntia tai enemmän tarkoittaa erittäin hyvää laatua ja alle 30 minuuttia huonoa laatua.
Vaihtelu on olennainen opetus. 5 tunnin tuloksella ei ole yleispätevää laatuluokkaa. Se kuuluu sen määritelleen menetelmän yhteyteen. Perusteltu raportointimuoto on siksi:
MBRT on X tuntia nimetyn menetelmän mukaan ja vastaa kyseisen menetelmän laatuluokkaa.
Se ei koskaan ole: MBRT on X pesäkettä muodostavaa yksikköä per mL. Standard Methods -julkaisuun perustuvassa ohjeistuksessa todetaan, ettei väriaineen pelkistymistuloksia pidä raportoida bakteerimäärinä. Myös yksinkertainen värjäysmenetelmä metyleenisinisellä vastaa eri kysymykseen, sillä se näyttää solujen muodon mikroskoopissa eikä putken kokonaisaktiivisuutta.
Tulkinta- ja rajoitustaulukko
Tämä taulukko on artikkelin alkuperäinen viitetaulukko. Lue aina koko rivi. Yksittäistä solua ei pidä tulkita irrallaan muista.
| Havainto tai väite | Mitä se osoittaa | Mitä se ei voi todistaa | Tärkeimmät häiriötekijät |
|---|---|---|---|
| Sininen väri häviää nopeasti, alle 2 tunnissa yhdessä raakamaidon luokituksessa | Suuri pelkistysaktiivisuus, joka sopii yhteen suuren mikrobikuorman tai heikon säilyvyyden kanssa | Lajia, tarkkaa määrää, toksiineja tai pastöroinnin epäonnistumista | Säilytys lämpimässä, runsaasti koliformeja sisältävä mikrobisto, valo, pieni väriaineannos |
| Keskipitkä aika, 2–4 tuntia | Kohtalainen aktiivisuus; laatuluokka pätee vain nimetyn luokituksen sisällä | Turvallisuutta tai hitaasti pelkistävien mikrobien puuttumista | Korkea inkubointilämpötila, erot ilmastumisessa, rasvan erottuminen |
| Hidas pelkistyminen, 5 tuntia tai enemmän | Vähäinen kokonaisaktiivisuus kyseisessä luokituksessa | Taudinaiheuttajien puuttumista, pastörointia tai kemiallista turvallisuutta | Antibioottijäämät, säilöntäaineet, ylimääräinen liuennut happi, suuri väriaineannos |
| Pinnalla säilyy sininen rengas, vaikka muu sisältö menettää värinsä | Uudelleenhapettuminen ilman rajapinnassa, normaali reunailmiö | Testin epäonnistumista tai epätäydellistä reaktiota | Leveä putki, löysä tulppa, toistuva avaaminen tarkastusta varten |
| Valkoinen putki kuumennetun maidon inkuboinnin jälkeen | Muuttunut pelkistysjärjestelmä sekä jäljelle jäänyt aktiivisuus | Että kuumennus vastasi validoitua pastörointia | Lämpövauriot, vaurioiden korjaantuminen inkuboinnin aikana, myöhempi kontaminaatio |
| Mikä tahansa yksittäinen MBRT-arvo, joka ilmoitetaan ilman menetelmää | Testiolosuhteet eivät ole tiedossa | Mitään laatuluokkaa tai määrää | Väriaineen koostumus, suhde, lämpötila, sekoitus ja päätepisteen määrittely ovat kaikki ilmoittamatta |
Kasvuun perustuvat tutkimukset, kuten bakteeriviljely kasvatusalustoilla, ovat edelleen keino mikrobien määrän määrittämiseen ja niiden eristämiseen. Pelkistysputki seuloo. Malja tunnistaa ja laskee.
Mitä testi ei voi todistaa turvallisuudesta
Hidas tulos ei voi todistaa taudinaiheuttajien puuttumista. Taudinaiheuttaja, jota on näytteessä kliinisesti merkittävä määrä, saattaa vaikuttaa vain vähän hapen kokonaiskulutukseen. Taudinaiheuttajien osoittaminen kuuluu mikrobikohtaisiin menetelmiin, joita nykyinen Standard Methods käsittelee yleisestä laatuseulonnasta erillisenä osa-alueena.
Testi ei voi varmistaa pastörointia. Lämpökäsittelyn varmistamiseen käytetään alkalisen fosfataasin testiä tai muuta validoitua menetelmää Codexin maitotuotteiden hygieniaohjeiden mukaisesti. Valkoinen tai sininen putki ei kerro mitään erän aika-lämpötilahistoriasta.
Testi ei voi vahvistaa elintarvikkeen turvallisuutta. Turvallisuuteen vaikuttavat taudinaiheuttajat, ennalta muodostuneet toksiinit, lääkejäämät, kemialliset vierasaineet, kylmäketjun historia ja näytteenoton jälkeinen kontaminaatio. Codex käsittelee maitotuotteiden turvallisuutta hallintatoimien ketjuna, ei yksittäisenä seulontatuloksena.
Elintarvikelaboratorion toimintaympäristö ei ole kotitestausta
Maitolaboratoriossa testillä seulotaan vastaanotettavaa maitoa, vertaillaan toimittajia ajan mittaan tai opetetaan redox-mikrobiologiaa valvotusti. Näytteet ovat jäljitettävissä. Reagenssit ovat standardoituja. Lämpötilat kirjataan. Jätteet käsitellään laboratorion jätehuollossa.
Kotitestauksessa mikään näistä ei toteudu. Keittiössä mitatut tilavuudet ovat likimääräisiä. Verkossa myytävien väriaineiden pitoisuudet vaihtelevat suuresti. Inkubointi tapahtuu usein lämpimässä huoneessa kalibroidun vesihauteen sijasta. Väri muuttuu silti, mikä saa tuloksen tuntumaan luotettavalta, vaikka kaikki sille merkityksen antaneet kontrollit puuttuvat.
Vakavampi riski liittyy käyttäytymiseen. Kotona sininen putki houkuttelee juomaan raakamaitoa, jonka laboratorio lähettäisi edelleen pesäkemäärityksiin, taudinaiheuttajien seulontaan ja jäämätutkimuksiin. Maidon metyleenisininen-testi suunniteltiin vastaanotettavan raakamaidon laatuluokitukseen, ei maidon hyväksymiseen nautittavaksi. Nopeammalla resatsuriiniseulonnalla on sama rajoitus: väritulos saadaan nopeammin, mutta vastausta taudinaiheuttajien esiintymiseen ei edelleenkään saada.
Tiivis sääntö laboratoriotyöhön
Vakioi väriaine, suhde, lämpötila, sekoitus, valo ja päätepiste. Raportoi aika yhdessä menetelmän nimen ja laatuluokan kanssa. Tulkitse minuutteja säilytyshistorian, mikrobiston tyypin, jäämien ja näytteenoton laadun yhteydessä. Lyhyt aika osoittaa aktiivisuutta, jota kannattaa tutkia. Pitkä aika ei koskaan vahvista turvallisuutta.