Artikkeli
Metyleenisinisen pelkistymiskoe pötsinesteelle
Vastavalmistunut eläinlääkäri soittaa maatilalta sininen koeputki kädessään. Hän lisäsi metyleenisinistä pötsinesteeseen kymmenen minuuttia sitten, ja sininen väri on yhä jäljellä. Hän kysyy, pitäisikö lehmälle antaa lisää väriainetta.
Kysymys paljastaa väärän käsityksen kokeesta. Pötsinesteen metyleenisinisen pelkistymiskokeessa väriaine lisätään koeputkeen, ei koskaan eläimeen. Koko määritys tapahtuu koeputkessa. Sinisen värin häviämiseen kuluvan ajan mittaaminen kertoo jotakin kyseisen näytteen mikrobeista, ei eläimen tarvitsemasta hoidosta.
Sekaannus on ymmärrettävä, sillä metyleenisinistä käytetään kolmessa erillisessä eläinlääketieteellisessä yhteydessä. Tässä artikkelissa ne erotetaan toisistaan ja kuvataan, miten pelkistymisaikaa tulkitaan yhdessä pH:n, alkueläinten, näytteenoton laadun ja kliinisten oireiden kanssa.
Mitä koe todella mittaa
Metyleenisininen on hapettuneena sinistä ja pelkistyneenä lähes väritöntä. Terveen eläimen tuore pötsineste on voimakkaasti pelkistävää, koska anaerobiset bakteerit fermentoivat rehua aktiivisesti. Kun tällaiseen nesteeseen sekoitetaan pieni määrä väriainetta, bakteerien aineenvaihdunta poistaa värin muutamassa minuutissa.
Toimintaperiaate on siis yksinkertainen: aktiivinen anaerobinen mikrobisto poistaa sinisen värin nopeasti, toimimaton tai vaurioitunut mikrobisto hitaasti. Lyhyt aika tarkoittaa kyseisen näytteen suurempaa pelkistyskykyä. Pitkittynyt aika viittaa heikentyneeseen mikrobitoimintaan, jos näyte on otettu ja käsitelty asianmukaisesti.
Koe ei mittaa suoraan pötsin hapetus-pelkistyspotentiaalia. Nautojen tutkimusmenetelmiä käsitelleessä tutkimuksessa verrattiin pelkistymiskoetta suoriin millivolttimittauksiin. Pelkistymisajan ja mitatun hapetus-pelkistyspotentiaalin välillä ei havaittu lineaarista korrelaatiota, ja tutkimuksessa todettiin, ettei niitä pidä käsitellä saman muuttujan keskenään korvaavina mittaustuloksina. Vertailun yhteenveto on saatavilla PubMedissä. Ajattele pelkistymiskoetta mikrobipopulaation toiminnallisena määrityksenä, älä edullisena elektrodina.
Merck/MSD:n kuvaus märehtijöiden yksinkertaisesta ruoansulatushäiriöstä liittää pitkittyneen pelkistymisajan samaan kokonaisuuteen kuin poikkeavan pötsin pH:n ja vähentyneen alkueläinmäärän. Mikään yksittäinen arvo ei ratkaise diagnoosia. Havaintojen kokonaisuus ratkaisee.
Tavanomainen tutkimusmenetelmä eläimen luona
Menetelmät vaihtelevat hieman oppilaitosten välillä, joten kirjaa käyttämäsi tarkat tilavuudet ja lämpötila ja vertaa vain samalla menetelmällä saatuja tuloksia. Yksi yleisesti opetettu menetelmä on seuraava:
- Ota vähintään 10–20 mL tuoretta pötsinestettä ja minimoi syljen sekoittuminen, altistuminen ilmalle ja jäähtyminen. Tee koe viipymättä.
- Valmista 0.03-prosenttista metyleenisiniliuosta, jonka pitoisuus on 0.3 mg/mL.
- Lisää väriainetta määrä, joka vastaa 5 prosenttia nesteen tilavuudesta. Tämä tarkoittaa 1.0 mL väriainetta 20 mL:aan nestettä tai 0.5 mL väriainetta 10 mL:aan nestettä. Molemmissa nesteen ja väriaineen suhde on 20:1.
- Pidä toisessa koeputkessa käsittelemätöntä nestettä samasta näytteestä värivertailua varten.
- Sekoita varovasti, käynnistä ajanotto heti ja pidä koeputki lähellä ruumiinlämpöä, noin 37–39 celsiusasteessa paikallisen menetelmäohjeen mukaan.
- Kirjaa aika, jonka kuluttua koekoeputken väri vastaa vertailuputkea. Nesteen ja ilman rajapintaan voi jäädä ohut sininen rengas, koska happi hapettaa väriaineen siinä uudelleen. Älä odota tämän renkaan häviämistä.
Metyleenisinisen hapetus-pelkistyskemia selittää, miksi hapella on tässä merkitystä. Voimakas ravistaminen, laajalti avoin koeputki tai pitkä viive päästää näytteeseen happea ja pitää väriaineen sinisenä pidempään kuin pötsissä. Myös huolellisen pötsinesteen näytteenottotekniikan yksityiskohdat ovat samasta syystä tärkeitä. Sylki laimentaa näytettä ja nostaa pH:ta, joten mahaletkua käytettäessä monet eläinlääkärit hylkäävät ensimmäisen näyteosuuden, jos nestettä saadaan riittävästi.
Mitä eri havainnot mittaavat
Pelkistymisaika vastaa vain yhteen kysymykseen. Alla oleva pötsin arviointitaulukko osoittaa, mitä kukin eläimen luona tehtävä havainto tuo arvioon. Käytä koko riviä, älä vain yhtä solua.
| Havainto | Mitä se mittaa | Tyypillinen löydös eläimen luona | Yleiset tulkintaa häiritsevät tekijät |
|---|---|---|---|
| Metyleenisinisen pelkistymisaika | Näytteen anaerobisten bakteerien toiminnallinen pelkistysaktiivisuus | Naudoilla usein 2–6 minuuttia; lampailla ja vuohilla usein nopeampi. Riittävän aktiivisuuden käytännön raja-arvona käytetään 6 minuuttia, ja yli 10 minuutin ajat ovat selvästi poikkeavia | Kylmä, viiveellä tutkittu, ilmalle altistunut tai syljen laimentama näyte; vähäinen substraatin määrä pitkittyneen syömättömyyden jälkeen; suun kautta annetut mikrobilääkkeet; eri väriainesuhteilla tai lämpötiloissa saatujen tulosten vertailu |
| Pötsin pH | Kemiallinen ympäristö, happo- tai emäskuormitus | Karkearehua syövillä naudoilla usein noin 6.0–7.2; pieniä märehtijöitä käsittelevissä oppikirjoissa mainitaan usein noin 6.5–7.5; ruokavalio ja ruokinnasta kulunut aika muuttavat arvoa | Syljen sekoittuminen nostaa mahaletkunäytteiden pH:ta; hiilidioksidin poistuminen näytteenoton jälkeen; viljaruokinta laskee pH:ta |
| Alkueläinten määrä ja liikkuvuus | Ripsieläinpopulaation eheys, erityisesti häiriöille herkkien suurten muotojen osalta | Lämpimässä tuoreessa pisarassa paljon erikokoisia organismeja, jotka liikkuvat vilkkaasti tiettyyn suuntaan | Jäähtyminen hidastaa liikettä; vaikea asidoosi voi hävittää alkueläimet; viive saa normaalin näytteen näyttämään vaisulta |
| Haju, väri ja koostumus | Fermentaation luonne ja kontaminaatio | Hieman aromaattinen, vihertävänruskea, lievästi viskoosi neste | Mädäntynyt tai hapan haju vaikeassa dysbioosissa; vetinen tai runsaasti sylkeä sisältävä neste puutteellisen näytteenoton jälkeen |
| Pötsin supistukset ja ruokahalu | Eläimen etumahojen kokonaistoiminta ja ravinnonsaanti | Säännölliset supistukset ja tasainen märehtiminen virkeällä eläimellä | Äskettäinen ruokinnan muutos, kipu, kuivuminen, yleissairaus |
Taulukon tarkoitus on juuri tämä. Pitkittynyt pelkistymisaika yhdessä vaisujen alkueläinten, poikkeavan pH:n ja heikkojen supistusten kanssa viittaa todelliseen mikrobitoiminnan heikkenemiseen. Yksittäinen pitkittynyt aika virkeällä, märehtivällä eläimellä, jonka alkueläimet liikkuvat vilkkaasti, viittaa näytteeseen eikä pötsiin. Ota uusi näyte ennen toimenpiteisiin ryhtymistä.
Ajan tulkinta pH:n ja esitietojen kanssa
Ruokavalio määrittää lähtötason. Runsaasti väkirehua sisältävät rehuannokset fermentoituvat nopeasti ja voivat poistaa väriaineen värin noin minuutissa, kun taas heinäruokinnalla siihen voi kulua useita minuutteja myös terveillä eläimillä. Nopea aika ei siis yksin osoita parempaa terveyttä. Se osoittaa, että aktiivisten mikrobien käytettävissä oli enemmän fermentoituvaa substraattia.
Voimakas viljan liikasaanti rikkoo tämän yksinkertaisen yhteyden. Hiilihydraattien fermentaatio voi aluksi olla voimakasta, mutta sitten happovaurio heikentää normaalia mikrobistoa ja alkueläimiä, jolloin pelkistymisaika pitenee. Siksi yhden opetuksessa käytetyn säännön mukaan koe ei ole pätevä, kun pötsin pH on alle noin 5.5. Siinä vaiheessa tutkittava mikrobisto on muuttunut.
Käytännön tulkintaohje:
- Normaali pH ja pelkistyminen noin 6 minuutin kuluessa viittaavat toiminnallisesti aktiiviseen mikrobistoon.
- Normaali pH ja selvästi pitkittynyt pelkistymisaika viittaavat syömättömyyden tai mikrobilääkkeen aiheuttamaan toiminnan heikkenemiseen tai näytteen laadun ongelmaan.
- Korkea pH ja pitkittynyt pelkistymisaika seuraavat usein pitkään jatkunutta syömättömyyttä, jolloin substraattia on vähän. Huomioi kuitenkin letkun kautta näytteeseen sekoittunut sylki.
- Matala pH ja vähentynyt alkueläinten aktiivisuus herättävät epäilyn hiilihydraatteihin liittyvästä dysbioosista. Pötsin pH:n tulkintaohjeista on tässä apua. Alle 5.5 olevat arvot yhdessä eläimen yleistilan heikkenemisen kanssa viittaavat yksinkertaisen ruoansulatushäiriön sijaan viljan liikasaantiin ja vaikeaan asidoosiin.
Kirjaa aina viimeaikainen suun kautta annettujen tetrasykliinien käyttö, rehun ionoforit, pitkäaikainen systeeminen mikrobilääkitys, äkilliset ruokinnan muutokset, syömättömyyden kesto ja vedenkulutus. MSD:n käsikirja varoittaa erityisesti siitä, että suun kautta annetut tetrasykliinit voivat heikentää pötsin mikrobistoa huomattavasti. Ionoforit muuttavat bakteeripopulaatioita tarkoituksellisesti. Ilman näitä esitietoja pitkittynyttä aikaa ei voi tulkita.
Näytteenoton laatu ansaitsee yhtä suuren painoarvon. Kontrolloidussa tutkimuksessa mahaletkulla otettujen näytteiden pH oli korkeampi ja haihtuvien rasvahappojen pitoisuus pienempi kuin samojen eläinten kanyylinäytteissä, pääosin syljen vuoksi. Pelkistymisaika oli pidentynyt merkitsevästi 60 minuutin kuluttua näytteenotosta kaikilla tutkituilla tilavuuksilla, ja vaikutus oli suurin pienissä näytteissä. Ota vähintään 10 mL, tutki näyte 30 minuutin kuluessa, tee pelkistymiskoe varhaisessa vaiheessa, pidä näyte lämpimänä ja minimoi kosketus ilman kanssa.
Kolme käyttötapaa, joita ei saa sekoittaa
Sama väriaine, kolme eri järjestelmää.
Ensimmäinen on tässä kuvattu pötsinesteen määritys. Näytteenä on eläimestä otettu pötsineste. Väriainetta lisätään in vitro 0.03-prosenttisena liuoksena. Päätepiste on värin häviämiseen kulunut aika. Tarkoituksena on arvioida mikrobien pelkistysaktiivisuutta.
Toinen on metyleenisinisen antaminen elävälle märehtijälle. Vakiintunut esimerkki on laskimonsisäinen hoito nitraatti- tai nitriittimyrkytyksessä, johon liittyy methemoglobinemia. Tällöin lääke palauttaa hemoglobiinin toimintakyvyn. Annosta, valmistemuotoa, jäämiä ja varoaikoja koskevat säännöt pätevät. Tämä päätös ei liity mitenkään koeputken ajanottoon. Jos väriainetta käytetään in vivo merkkiaineena tietyssä toimenpiteessä, tarkastelun kohteena on väriaineen kulkeutuminen, ei se, kuinka nopeasti pötsin mikrobit pelkistävät sitä.
Kolmas on maidon pelkistymiskoe. Näytteenä on maito. Väriaine lisätään maitonäytteeseen. Sinisen värin nopea häviäminen viittaa yleensä suurempaan mikrobitoimintaan ja huonompaan säilyvyyteen, kun taas hidas pelkistyminen viittaa parempaan laatuun. Koe kuuluu elintarvikemikrobiologiaan ja maidon laadun testaukseen, ei pötsin sairauksien tutkimiseen, eikä se mittaa bakteerimäärää.
Täsmälliset nimet ehkäisevät virheitä: pötsinesteen pelkistymisaika, systeeminen metyleenisinihoito tai merkkiainekäyttö sekä maidon pelkistymiskoe. Turvallisuussääntö mahtuu yhteen lauseeseen. Pötsinesteen määrityksen väriaine pysyy laboratorion koeputkessa, ja koeputki hävitetään. Väriainetta ei koskaan anneta eläimelle tämän kokeen suorittamiseksi.
Tiivis ohje tilakäynnille
Vakioi väriaineen pitoisuudeksi 0.03 prosenttia ja suhteeksi 1 osa väriainetta 20 osaan nestettä. Tutki tuore neste lähellä ruumiinlämpöä käyttäen käsittelemätöntä vertailunäytettä ja tulkitse minuutit yhdessä pH:n, alkueläinten liikkuvuuden, näytteenoton laadun, ruokavalion, lääkkeiden, supistusten, ruokahalun, ulosteiden ja nesteytystilan kanssa. Yksittäinen luku ei koskaan riitä ruoansulatushäiriön diagnoosiin. Yhtäpitävä havaintojen kokonaisuus riittää.