Metyleenisinisen kalibrointikäyrän laatiminen: nollanäytteet, alue ja lineaarisuus

Kaksi analyytikkoa käyttää samaa metyleenisinisen kantaliuospulloa ja laatii kumpikin kalibrointikäyrän. Ensimmäinen saa origon kautta kulkevan suoran ja mittaa tuntemattomia näytteitä luottavaisin mielin. Toinen saa yläpäästään kaartuvan käyrän, vakiotermin, joka ei asetu lähelle nollaa, ja näytetuloksia, jotka muuttuvat laimennuksen mukana. Sama väriaine, sama laite, sama aallonpituus. Ero ei ole taidoissa vaan suunnittelussa: mitä nollanäytteeseen lisättiin, mitkä pitoisuudet valittiin ja pysyikö tarkistettu alue sellaisella alueella, jolla yksi yksinkertainen malli vielä pätee.

Kalibrointikäyrä on laitteen vasteen ja pitoisuuden välinen sopimus, joka pätee vain niissä olosuhteissa, joissa se laadittiin. Metyleenisinisellä tässä sopimuksessa on tunnettu heikko kohta. Väriaine assosioituu vedessä, joten absorboiva kemiallinen muoto muuttuu pitoisuuden mukana. Tämän muutoksen yli laadittu käyrä ei ole suora, eikä mikään määrä tilastollista käsittelyä korjaa sitä. Tässä artikkelissa kuvataan, miten käyrä suunnitellaan niin, että suoralla on todellinen merkitys: valitaan oikea nollanäyte, pidetään alue monomeerivaltaisena, tehdään aidot rinnakkaismääritykset ja tulkitaan kaarevuus tiedoksi eikä kohinaksi.

Aloita nollanäytteestä, älä standardeista

Nollanäyte määrittää nollatason, ja metyleenisinistä mitattaessa sen on sisällettävä kaikki muu paitsi väriaine. Sama veden laatuluokka, sama puskuri ja pH, samat suolat, sama apuliuottimen osuus, sama lämpötila. Valmista kalibrointiliuokset tähän täsmälleen samaan matriisiin. Syy on kemiallinen, ei byrokraattinen. Suola ja liuotin muuttavat monomeerin, dimeerin ja suurempien aggregaattien välistä tasapainoa, mikä muuttaa spektriä mittausaallonpituudella. Pelkkää vettä sisältävä nollanäyte ei voi korjata matriisin aiheuttamaa muutosta kemiallisten muotojen jakaumassa. Metyleenisinisen vesispektrien kokonaisanalyysissä, joka on saatavilla avoimena kokotekstinä, natriumkloridipitoisuutta vaihdeltiin välillä 0–0.15 M juuri siksi, että ionivahvuus siirtää tasapainoa, ja aggregaatio lisääntyi suolan mukana.

Yksi käytännön seuraus: älä koskaan kalibroi deionisoidussa vedessä ja mittaa sitten näytteitä fosfaattipuskurissa tai jätevesisuodoksessa. Jos analyyttiä sisältämätöntä matriisia ei ole saatavilla, standardilisäys suoraan näytteeseen on parempi vaihtoehto kuin matriisia vastaamaton ulkoinen kalibrointikäyrä. Vesiliuosten määritysten luotettavuutta käsitellään tarkemmin matriiseja ja häiriöitä koskevassa osiossa, ja kvantitatiivisten väriaineanalyysien yleiset periaatteet esitetään määritysten suunnittelua käsittelevässä yleiskatsauksessa.

Valitse alue, jolla yksi kemiallinen muoto hallitsee

Kvantitatiivinen määritys pitkän aallonpituuden absorptiokaistalla lähellä 664 nm:ä olettaa, että suurin osa väriaineesta on monomeerimuodossa. Pelkässä vedessä tämä oletus pätee vain, kun liuokset pysyvät laimeina, suunnilleen pienissä mikromolaarisissa pitoisuuksissa. Julkaistut kokeelliset kulmakertoimet havainnollistavat rajaa: kalibroinnit, joissa pitoisuudet pidetään alle noin 7 mikromolaarisina 1 cm:n kyveteissä, antavat kulmakertoimeksi noin 82,000 M-1 cm-1, kun taas noin 37 mikromolaariseen pitoisuuteen ulotetussa kalibroinnissa arvo laskee suunnilleen tasolle 67,100, koska suurimmat standardipitoisuudet sisältävät jo merkittävästi dimeeriä. Jokainen tässä mainittu kerroin on esitetty olosuhdetietoineen metyleenisinisen spektritietojen viiteartikkelissa, joka on oikea paikka lukujen vertailuun; tässä artikkelissa niitä käytetään vain alueen määrittämiseen.

Suunnittelusäännöt seuraavat tästä suoraan:

1. Pidä suurimman standardin pitoisuus niin pienenä, että spektrin muoto pysyy vakaana. Mittaa menetelmän kehitysvaiheessa jokaisella pitoisuustasolla koko näkyvän valon spektrialue (noin 550–750 nm) yhden aallonpituuden sijaan. Jos normalisoitujen spektrien muoto muuttuu pitoisuuden mukana, kemiallinen tasapaino muuttuu ja alue on liian laaja.
2. Seuraa lähellä 610 nm:ä mitatun absorbanssin suhdetta lähellä 665 nm:ä mitattuun absorbanssiin eri pitoisuustasoilla. Pitoisuuden kasvaessa suureneva suhde tarkoittaa, että dimeerin aiheuttama olake kasvaa eikä monomeerimalli enää päde. Tätä diagnostista tarkistusta selitetään tarkemmin aggregaatiota ja pitoisuuden vaikutuksia käsittelevässä oppaassa.
3. Käytä 1 cm:n kyvettiä pienillä mikromolaarisilla pitoisuuksilla. Kun kulmakerroin on lähellä arvoa 82,000, 5 mikromolaarinen pitoisuus antaa absorbanssiksi noin 0.41 ja 10 mikromolaarinen noin 0.82; molemmat ovat useimmille laitteille sopivia arvoja.
4. Lyhennä väkevien kantaliuosten optista matkaa sen sijaan, että hyväksyisit selvästi yli 1:n absorbanssin. Muista kuitenkin, että lyhyt optinen matka korjaa fotometrisen mittauksen, ei kemiallista tasapainoa. Aggregaatio riippuu pitoisuudesta, ei optisesta matkasta, joten väkevä kantaliuos tarvitsee silti oman, kemiallisten muotojen jakauman huomioivan käsittelynsä eikä laimeaan monomeerialueeseen perustuvaa käyrää.

Suuri osa tästä kokonaiskuvasta perustuu yhteissovitukseen, joka kattoi 224 spektriä pitoisuusvälillä 1.1 mikromolaarisesta 3.4 millimolaariseen ja jossa tetrameerin signaali havaittiin jo alle 34 mikromolaarisessa pitoisuudessa. Havainto antaa lähtökohdan: lineaarinen alue on kapeampi kuin intuitio antaa ymmärtää, joten varmista se sen sijaan, että olettaisit sen.

Pitoisuustasot, rinnakkaismääritykset ja mittausjärjestys

Kolmen pisteen käyrä ei todista mitään. ICH Q2(R2) -validointiohjeessa edellytetään vähintään viittä pitoisuutta lineaarisuuden arviointiin, ja kuudesta kahdeksaan nollasta poikkeavaa pitoisuustasoa tuottaa vakuuttavamman käyttökäyrän, etenkin yläpäässä, jossa aggregaatio alkaa. Sijoita tasot kattamaan näytteiden suunniteltu pitoisuusalue ja tihennä niitä siellä, missä kaarevuus on todennäköisintä, sen sijaan että valitsisit geometrisen sarjan helppouden vuoksi.

Mittaa jokainen taso kahtena tai kolmena toisistaan riippumattomasti valmistettuna rinnakkaisnäytteenä sen sijaan, että lukisit saman pullon kolme kertaa. Riippumattomat rinnakkaisnäytteet paljastavat valmistusvirheet; saman pullon toistomittaukset paljastavat vain laitteen kohinan. Vuoden 2020 kokonaisanalyysissä jokainen liuos mitattiin kolme kertaa, mikä on edelleen perusteltu lähtökohta. Satunnaista mittausjärjestys, jotta ryömintä, adsorptio lasiin tai lämpötilan muutos eivät voi näyttää kaarevuudelta. Kvartsikyvettejä koskevassa tutkimuksessa noin 3 prosenttia väriaineesta adsorboitui 34 mikromolaarisesta liuoksesta 10 minuutin kuluessa. Pidä siksi kosketusaika, kyvetti, puhdistus ja työvaiheiden järjestys yhdenmukaisina koko mittaussarjan ajan.

Havainnollistava laskuesimerkki (ei mitattua aineistoa)

Alla olevat luvut on keksitty laskennan havainnollistamiseksi. Ne eivät ole laboratoriomittauksia, eikä niitä saa käyttää metyleenisinistä koskevana mittausaineistona. Olennaista on niiden yhteydessä tehtävien tarkistusten kokonaisuus.

Oletetaan, että kuusi standardia on valmistettu samaan puskuriin ja mitattu 1 cm:n optisella matkalla 665 nm:ssä vastaavaa nollanäytettä vastaan:

Kun keskimääräinen absorbanssi sovitetaan suoraksi pitoisuuden funktiona, kulmakertoimeksi saadaan noin 0.0805 absorbanssiyksikköä mikromolaarista pitoisuutta kohti ja vakiotermi on muutaman milliabsorbanssiyksikön sisällä nollasta. Kulmakertoimen jakaminen optisella matkalla muuntaa sen näennäiseksi absorptiokertoimeksi: 0.0805 mikromolaarista pitoisuutta kohti vastaa noin arvoa 80,500 M-1 cm-1, mikä on yhdenmukainen veden monomeerivaltaisen pitoisuusalueen kanssa. Olennaiset tarkistukset eivät koske R:n neliötä, joka näyttää joka tapauksessa erinomaiselta. Tärkeitä ovat lähes nollan suuruinen vakiotermi, tasainen A610/A665-suhde tasoilla S2–S5 ja ilman trendiä hajautuneet jäännökset. Suhteen nousu tasolla S6 on aito merkki siitä, että taso on joko jätettävä pois tai 7 mikromolaarinen pitoisuus on merkittävä tämän matriisin ja laitteen yhdistelmän alustavaksi ylärajaksi.

Samoissa olosuhteissa tuntemattomasta näytteestä mitattu arvo 0.245 muunnetaan suoraan: 0.245 jaettuna kulmakertoimella 0.0805 mikromolaarista pitoisuutta kohti antaa noin 3.0 mikromolaarisen pitoisuuden ennen näytteen mahdollisen laimennuskertoimen huomioimista. Ilmoita tulos olosuhdetietoineen: aallonpituus, optinen matka, nollanäytteen matriisi, kalibrointialue ja päivämäärä.

Täytettävä kalibrointityöpohja

Kopioi tämä pohja laboratorion kirjanpitoon jokaista uutta matriisia varten. Yksi matriisi, yksi lomake, yksi käyrä.

Reagenssin muotoa koskeva rivi on tarpeellinen. Kaupallinen metyleenisininen voi olla vedetöntä suolaa tai hydraattia, kuten trihydraattia, ja väärä moolimassa vääristää huomaamatta jokaista nimellistä pitoisuutta. Lähtöaineen puhtauden ja spesifikaatioiden tarkistuksia käsitellään laatu- ja laatuluokkaoppaassa.

Varmenna riippumattomalla tarkistusstandardilla

Kalibrointikäyrä ei saa koskaan arvioida itse itseään. Valmista sovituksen jälkeen yksi tarkistusstandardi erikseen punnitusta kantaliuoksesta pitoisuuteen, joka on lähellä hyväksytyn alueen keskikohtaa, ja mittaa se tuntemattomana näytteenä. Muutaman prosentin sisällä oleva vastaavuus vahvistaa valmistusketjun toimivuuden; poikkeama viittaa kantaliuokseen tai laimennuksiin pikemmin kuin laitteeseen. Mittaa tarkistusstandardi jokaisen näyte-erän yhteydessä. Jos sen tulos ryömii käyrän pysyessä ennallaan, epäile työliuoksia tai kyvettiä ennen näytteitä. Tämä yksittäinen käytäntö havaitsee useimmat huomaamattomat virheet: hydraatin moolimassan käyttämisen vedettömälle aineelle, kalibroinnista poikkeavan mikropipetin tai väärään ionivahvuuteen valmistetun puskurin. Kirjaa tarkistusstandardin saanto työpohjaan kulmakertoimen viereen, jotta myöhempi lukija näkee, että suora on testattu eikä vain piirretty.

Epälineaarisuuden tulkinta syyn selvittämiseksi

Kun käyrä kaartuu, poikkeaman muoto auttaa tunnistamaan syyn. Alaspäin kaartuminen suurilla absorbansseilla spektrin muodon pysyessä ennallaan viittaa laitteeseen, usein hajavaloon, joka aiheuttaa suurten absorbanssien aliarviointia. Kaarevuus yhdessä kasvavan 610 nm:n olakkeen kanssa viittaa kemialliseen tasapainoon: dimeeri ja suuremmat aggregaatit absorboivat eri tavalla kuin monomeeri. Nollanäyte, jota ei saada nollattua, tai standardit, joiden lukemat pienenevät ajan myötä, viittaavat astiaan: adsorptioon lasiin tai kyvetteihin, etenkin jos kosketusajat vaihtelivat mittaussarjan aikana. Siisti suora, joka kulkee pisteiden kautta mutta antaa silti vääriä näytetuloksia, viittaa matriisiin: näytteet eroavat kalibrointiliuoksista, joten laadi käyrä uudelleen näytematriisissa tai siirry standardilisäykseen. Piirrä kaikissa tapauksissa jäännökset pitoisuuden funktiona. Satunnainen hajonta tukee suoramallia; hymy- tai surusuu osoittaa sen virheelliseksi luotettavammin kuin mikään R:n neliön raja-arvo, minkä myös validointiohjeet nimenomaisesti vahvistavat.

Metyleenisinisen kohdalla tällainen huolellisuus kannattaa. Sen monomeerin absorptiokaista on voimakas, sen kemia tunnetaan hyvin ja poikkeamat näkyvät spektrissä ennen kuin ne vääristävät lukuja. Laadi käyrä kapealle alueelle, käytä asianmukaista nollanäytettä, valmista rinnakkaisnäytteet riippumattomasti ja anna spektrien muodon ratkaista alue. Tuloksena syntyvä suora on lyhyt, mutta jokainen sen piste on luotettava.

Tämän artikkelin havainnollistavissa laskelmissa käytetään keksittyjä lukuja menetelmän esittelemiseksi. Mitatut vertailukertoimet täydellisine olosuhdetietoineen löytyvät linkitetystä spektritietojen viiteartikkelista, ja taustalla oleva aggregaatiotutkimus on indeksoitu tunnisteella PMID 33251415.