Metyleenisininen seeprakalatutkimuksessa: kasvatuksen lisäaine ja kokeellinen sekoittava tekijä

Seeprakalojen mätivesi on usein haalean sinistä, eikä juuri kukaan kirjaa syytä muistiin. Väriaine on metyleenisininen, jota lisätään sienikasvun torjumiseksi, ja useimmissa protokollissa sitä pidetään taustatekijänä. Taustatekijä on tässä väärä käsite. Parempi olisi kirjaamaton kokeellinen tekijä: aine, jota on käsitellyissä maljoissa mutta ei kontrolleissa, joka on farmakologisesti aktiivinen käytetyillä pitoisuuksilla ja joka voi muuttaa juuri niitä vastemuuttujia, joita kokeessa mitataan.

Tämä ero jäsentää kaikkea seuraavaa. Rutiininomainen sienikasvun torjunta kasvatuksessa on yksi kysymys. Se, onko lisäaine neutraali käyttämäsi määrityksen kannalta, on toinen. Viimeaikainen seeprakalakirjallisuus vastaa ensimmäiseen rauhoittavasti ja toiseen huolestuttavasti.

Mitä ohjeet todella määräävät

Yhtä yhteistä standardia ei ole, ja se on osa ongelmaa. Canadian Council on Animal Care -järjestön ohjeistus sallii pitoisuuden 0.5 mg/L eli 0.00005% mädin ja toukkien kuljetusliuoksessa sienikasvun vähentämiseksi. Eurooppalaisissa koe-eläinohjeissa kuvataan alkioiden pitämistä kasvatusliuoksessa, joka usein sisältää saman pitoisuuden, 0.00005%. Cold Spring Harborin E3-reseptissä määrätään kaksinkertainen määrä, 1 mg/L eli 0.0001%, reseptin ainesosaksi. Tämän vastapainona on silmiinpistävä puute: OECD:n kalan alkiotoksisuustestin ohjeessa määrätään koostettu laimennusvesi ja testikemikaali, mutta metyleenisinistä ei suositella vuoden 2013 versiossa eikä myöhemmässä tarkistuksessa. Niinpä yksi laboratorio kasvattaa seeprakalan alkioita metyleenisinistä sisältävässä sinisessä vedessä ensimmäisistä elintunneista lähtien, toinen tekee sääntelyn mukaista alkiotestiä kirkkaassa vedessä, ja molemmat kutsuvat kasvatusliuostaan normaaliksi. Jokainen, joka vertaa laboratorioiden tuloksia tai yhdistää aiempia kontrolliaineistoja, joutuu käsittelemään tätä epäjohdonmukaisuutta.

Pitoisuuksien hahmottamiseksi 0.00005% on noin 1.56 mikromolaarinen ja 0.0001% noin 3.13 mikromolaarinen. Luvut ovat pieniä, ja niitä on houkuttelevaa pitää liian pieninä ollakseen merkityksellisiä. Alla kuvatuissa tutkimuksissa testataan juuri tätä oletusta juuri näillä pitoisuuksilla.

Akvaarioharrastuksen parista tulevat lukijat kohtaavat saman molekyylin eri ympäristössä, jota käsitellään metyleenisinisen akvaariokäytön oppaassa. Kemia on sama; kuvaus siitä, miten väriaine kuljettaa elektroneja soluissa, selittää, miksi redox-aktiivinen yhdiste esiintyy toistuvasti aineenvaihduntatutkimuksissa. Seuraava käsittely koskee nimenomaan metyleenisinistä sisältävää seeprakalojen mätivettä.

Aineenvaihdunta: vaikutuksen suunta muuttuu kehitysvaiheen mukaan

Informatiivisimmassa tutkimuksessa normaalisti kehittyviä seeprakaloja altistettiin ensimmäisestä elinpäivästä 5 päivään hedelmöityksen jälkeen, ja oksidatiivista aineenvaihduntaa mitattiin kussakin kehitysvaiheessa, kuten alkioiden aineenvaihduntakokeiden julkaistussa raportissa kuvataan. Havaittu kuvio on syytä esittää tarkasti, sillä sen suunta kääntyy.

1 päivänä hedelmöityksen jälkeen altistettujen alkioiden perushapenkulutus kasvoi kummallakin kasvatuksessa käytetyllä pitoisuudella. 2 päivän kohdalla toukkien pintakerroksen mitokondrioiden kalvopotentiaali oli koholla altistuksissa, joiden pitoisuudet olivat 0.00005%, 0.0001% ja 0.0003%. 4–5 päivän kohdalla, kuoriutumisen jälkeen, suunta oli kääntynyt: oksidatiivinen energiankulutus väheni riippumatta siitä, oliko altistus jatkunut hedelmöityksestä lähtien vai ollut akuutti vain päivästä 3 päivään 4. Samanaikaisesti mitokondrioiden hengitysketjun kompleksien alayksiköiden transkriptien määrät vähenivät sekä 1 että 4 päivän kohdalla, samoin kuin steroidogeneesiin ja glukoneogeneesiin liittyvien transkriptien määrät.

Kaksi muuta havaintoa tarkentaa kuvaa. Kuoriutuminen aikaistui hieman suuremmalla kasvatuspitoisuudella: altistetut alkiot olivat edellä 2 päivän kohdalla, ja kontrollit saavuttivat ne päivään 3 mennessä. Stressiakseli itsessään vaikutti kuitenkin toimivan normaalisti: kun 5 päivän ikäisiin toukkiin kohdistettiin pyörittämällä aiheutettu stressitekijä, koko kehon kortisolipitoisuus nousi normaalisti kummassakin ryhmässä. Väriaine ei siis näillä annoksilla ole yleinen kehitysmyrkky, eikä se vaimenna kaikkia fysiologisia vasteita. Se muuttaa energia-aineenvaihduntaa kehitysvaiheesta riippuen: lisää sitä ennen kuoriutumista ja vähentää sitä sen jälkeen.

Käyttäytyminen: miksi kaksi tutkimusta ovat eri mieltä ja miksi molemmat voivat olla oikeassa

Käyttäytymistä koskeva kirjallisuus vaikuttaa ristiriitaiselta, kunnes altistusasetelmia tarkastellaan rinnakkain. Yhdessä kehitystä ja käyttäytymistä koskevassa turvallisuustutkimuksessa alkioita altistettiin noin 6 tunnista hedelmöityksen jälkeen alkaen enintään 10 mikromolaarisille pitoisuuksille. Liuokset vaihdettiin päivittäin päivään 4 asti, minkä jälkeen toukat siirrettiin väriaineettomaan kasvatusliuokseen päiviksi 5 ja 6. Liikkumista testattiin valo–pimeätestissä päivänä 6. Tulos: ei merkittävää vaikutusta kuolleisuuteen, kuoriutumiseen tai morfologiaan eikä käsittelyn vaikutusta liikkumiseen. Kirjoittajat suosittelivat perustellusti 10 mikromolaarista pitoisuutta ylärajaksi omissa koeolosuhteissaan.

Toinen ryhmä, jolla oli osittain samat kirjoittajat kuin aineenvaihduntatutkimuksessa, toteutti altistuksen kuten kasvatuksessa käytännössä toimitaan: väriaine oli mukana 2–3 tunnista hedelmöityksen jälkeen alkaen, liuos vaihdettiin osittain päivittäin, ja käyttäytymistä mitattiin altistuksen jatkuessa tai pian sen jälkeen. Samoilla rutiinipitoisuuksilla toukkien liikkuminen väheni 24 tunnin testissä. Tulos toistui eri kannoissa ja laboratorioissa, ja käyttäytymisen sekoittavia tekijöitä käsittelevä tutkimus yhdisti vaikutuksen serotonergiseen aktiivisuuteen, mikä sopii yhteen väriaineen tunnetun monoamiinioksidaasia estävän vaikutuksen kanssa. Erityisen huomionarvoista oli, että metyleenisinistä sisältävä alkioiden kasvatusliuos peitti odotetun liikkumisvasteen SSRI-lääke fluoksetiinille. Sinisessä vedessä tehtävä seulontatesti voi siis jättää havaitsematta lääkevaikutuksen, joka näkyisi kirkkaassa vedessä.

Todellista ristiriitaa ei ole. Yhdisteestä ei välttämättä jää yhdessä testissä havaittavaa vaikutusta kahden päivän kuluttua altistuksen lopettamisesta, mutta se voi silti olla aktiivinen toisessa testissä ollessaan läsnä. Käytännön tulkinta on, että nollatulos perustelee pitoisuuden ylärajan, ei väitettä neutraaliudesta. Positiivinen tulos puolestaan kuvaa olennaista riskiä: aktiivista altistusta mittausjakson aikana juuri siinä asetelmassa, jota useimmat laboratoriot käyttävät.

Redox-väriaine redox-määrityksessä

Vielä yksi sudenkuoppa ansaitsee oman kappaleensa, sillä se vääristää eläimen sijasta mittausmenetelmää. Alamar Blue -energiankulutusmääritys perustuu itsessään redox-kemiaan: resatsuriini pelkistyy fluoresoivaksi resorufiiniksi. Myös metyleenisininen osallistuu redox-reaktioihin. Soluttomissa kontrolleissa kumpikin kasvatuspitoisuus vähensi Alamar Blue -fluoresenssia hieman mutta merkitsevästi 24 tunnin jälkeen. Eläinkokeissa altistetut alkiot huuhdeltiin vähintään kolme kertaa väriaineettomassa kasvatusliuoksessa ennen määritystä, ja kuoriutuneiden toukkien biologinen vaikutus oli suurempi kuin soluttomissa kontrolleissa havaittu häiriö. Molemmat havainnot ovat siis tosia: huuhdelluilla eläimillä on todellinen aineenvaihduntavaikutus, ja poistamatta jätetty väriaine lisää sen päälle suoran kemiallisen artefaktin. Kontrollien on erotettava nämä toisistaan, tai kumpikaan lukema ei merkitse mitään. Yleiset ohjeet väriainepohjaisten määritystulosten tulkintaan pätevät tässä poikkeuksellisen vahvasti.

Kehitysvaiheiden aikajana

Tätä artikkelia varten laadittu alkuperäinen aineisto. Pitoisuudet ovat kaksi tavanomaista kasvatuspitoisuutta, 0.00005% ja 0.0001%, ellei toisin mainita.

Muistettava kokonaiskuva on aineenvaihdunnan vastemuuttujien varhainen nousu ja myöhempi lasku. Käyttäytymisvaikutuksia esiintyi altistuksen aikana, mutta niitä ei havaittu aineen poistumisen jälkeen siinä yhdessä testissä, jossa tätä tutkittiin.

Kontrollien suunnittelun tarkistuslista

Toinen alkuperäinen aineisto. Käytä sitä, kun metyleenisinistä sisältävät seeprakalaprotokollat yhdistyvät kokeeseen.

1. Raportoi väriaine reagenssina, älä vetenä. Ilmoita pitoisuus sekä prosentteina että mikromolaarisena, altistuksen aloitus ja lopetus tunteina tai päivinä hedelmöityksen jälkeen, liuoksen vaihtoaikataulu sekä altistukseton jakso ennen kutakin mittausta.
2. Sovita kontrollit tutkimuskysymykseen. Testikemikaalin tutkimus tarvitsee väriaineettomat kontrollit; kasvatusta koskeva tutkimus tarvitsee väriaineettoman ja väriainetta sisältävän koeryhmän sekä kirjatun tuloksen sienikasvun torjunnasta, sillä kumpikaan mainituista tutkimuksista ei mitannut sienikasvun torjunnan tehoa.
3. Huuhtele ennen redox-määrityksiä ja varmista sitten tulos. Huuhtele vähintään kolme kertaa väriaineettomassa kasvatusliuoksessa ja tee rinnalla soluton kontrolli, jossa on sekä väriaine että reagenssi, sillä väriaine heikentää Alamar Blue -signaalia suoraan.
4. Pidä käyttäytymiseen ja monoamiineihin liittyviä vastemuuttujia suuren riskin kohteina. Liikkumista, säpsähdysreaktioita, ahdistuksen kaltaista käyttäytymistä, masennuslääkkeitä ja MAO-estäjiä koskevissa tutkimuksissa tulisi välttää väriainetta mittauksen aikana tai osoittaa sen neutraalius kunkin vastemuuttujan osalta; yhden tai kahden päivän altistukseton jakso poisti yhden liikkumisvaikutuksen, mutta tätä ei ole osoitettu muissa koeasetelmissa.
5. Pidä aineenvaihduntaan ja mitokondrioihin liittyviä vastemuuttujia suuren riskin kohteina kaikissa kehitysvaiheissa. Hapenkulutus, energiankulutus, kalvopotentiaali ja hengitysketjun transkriptien määrät muuttuvat kasvatuspitoisuuksilla, vastakkaisiin suuntiin ennen kuoriutumista ja sen jälkeen.
6. Älä oleta neutraaliuden siirtyvän koeasetelmasta toiseen. Nollatulos altistuksettoman jakson jälkeen ei kata jatkuvaa altistusta; morfologiaa koskeva nollatulos ei kata aineenvaihduntaa tai lääkeaineen yhteisvaikutusta; yhdessä kannassa, lämpötilassa tai tietyn kestoisessa määrityksessä saatu tulos ei kata muita.
7. Ilmoita noudattamasi ohje ja sen vaihtoehto. Nimeä CCAC:n, eurooppalaisten ohjeiden tai Cold Spring Harborin pitoisuudet täsmällisesti ja mainitse, ettei OECD:n alkiotestissä käytetä väriainetta, jotta lukija voi hahmottaa eläintesi koeolosuhteet.

Mikään tästä ei puhu sen puolesta, että väriaineen käytöstä mädin elossa pitämiseen pitäisi luopua. Se puhuu sen puolesta, ettei kasvatuksessa tehty valinta saa siirtyä huomaamatta tutkimusdataan. Maljan sininen väri on molekyyli, jolla on farmakologisia vaikutuksia, ja todennäköisimmin vääristyvät juuri suuren läpimenon aineenvaihdunta- ja neurobehavioraaliset seulonnat, joissa nuoria seeprakaloja nykyään suositaan. Kirjaa se, kontrolloi se, huuhtele se pois ennen mittausta ja tarkista määritys, johon se saattaa huomaamatta osallistua.