Metyleenisininen ja tulehdussignalointi: inflammasomit, IL-6 ja STAT3

Oletetaan, että kolme laboratoriota raportoi saman sinisen yhdisteen olevan tulehdusta hillitsevä. Yksi osoittaa, että makrofageista vapautuu vähemmän IL-1betaa. Toinen osoittaa, että samassa solutyypissä on vähemmän iNOS-entsyymiä. Kolmas osoittaa, että veressä on vähemmän IL-6:ta ja aivoissa vähemmän STAT3-aktiivisuutta. Kolmen tuloksen yhdistäminen yhdeksi väitteeksi on houkuttelevaa. Yhdistäminen kuitenkin peittää varsinaiset havainnot.

Kukin tulos liittyy erilaiseen signalointikokonaisuuteen, jolla on oma käynnistäjänsä, kokoamisvaiheensa ja mitattava vasteensa. Metyleenisininen vaikuttaa kuhunkin eri kohdassa. Se, parantaako mikään tästä terveystuloksia, on erillinen kysymys, jota käsitellään metyleenisinistä ja tulehdusta koskevassa katsauksessamme. Tällä sivulla keskitytään signalointireitteihin.

Reitti 1: inflammasomin kokoaminen ja kaspaasi-1

Inflammasomi on proteiinirunko, joka kootaan tarvittaessa myelooisen solun sisällä. Sen osat ovat sensori, ASC-niminen sovitinproteiini ja kaspaasi-1-niminen efektorientsyymi. Kokoamisen jälkeen kaspaasi-1 pilkkoo pro-IL-1betan ja pro-IL-18:n erittyviksi muodoiksi ja voi käynnistää pyroptoosin eli tulehduksellisen solukuoleman. Sensori määrittää inflammasomin tyypin: NLRP3 reagoi kiteisiin ja huokosia muodostaviin toksiineihin, kuten nigerisiiniin ja ATP:hen, NLRC4 reagoi bakteerien flagelliiniin, AIM2 reagoi sytosoliseen kaksijuosteiseen DNA:han ja ei-kanoninen reitti reagoi solunsisäiseen lipopolysakkaridiin.

Aktivaatio vaatii kaksi signaalia. Ensimmäinen signaali on esiviritys: Tollin kaltaisen reseptorin ligandi käynnistää NLRP3:n ja pro-IL-1betan NF-kB-riippuvaisen transkription, jotta tarvittavat osat ovat olemassa. Toinen signaali on kokoaminen: toinen ärsyke saa ASC:n oligomerisoitumaan täpliksi, kaspaasi-1:n pilkkoutumaan p20-fragmentikseen ja kypsän IL-1beta p17:n vapautumaan. Mitokondrioiden reaktiiviset happiyhdisteet ja kiteiden sisäänotto ovat tunnettuja NLRP3:n toiseen signaaliin vaikuttavia tekijöitä.

Vuoden 2017 makrofagitutkimuksessa, jossa tarkasteltiin inflammasomien laaja-alaista estoa, metyleenisinistä testattiin molempien signaalien yhteydessä. Lipopolysakkaridilla esiviritetyissä hiiren luuydinmakrofageissa nigerisiini, ATP ja mononatriumuraattikiteet aiheuttivat kukin IL-1betan ja kaspaasi-1:n vapautumista sekä ASC-täplien muodostumista. Metyleenisininen pitoisuuksilla 20–200 micromolar vähensi kaikkia kolmea annosriippuvaisesti tappamatta soluja. Sama kuvio havaittiin, kun NLRC4:ää aktivoitiin flagelliinilla ja Salmonellalla, AIM2:ta kaksijuosteisella DNA:lla ja Listerialla sekä ei-kanonista reittiä transfektoidulla lipopolysakkaridilla tai elävällä E. colilla. Yhdiste yksinään ei käynnistänyt vapautumista, eikä kontrollimaljoissa havaittu antibakteerista vaikutusta, joten tulos liittyy isännän vasteeseen.

Reitin aiemmissa vaiheissa mitattiin kolmea vaikutuskohtaa. Rotenonin aiheuttama mitokondrioiden superoksidituotanto väheni metyleenisinisen vaikutuksesta, ja samalla väheni rotenonin aiheuttama IL-1betan vapautuminen. Fluoresoivien helmien sisäänotto väheni, mikä sopii fagosytoosin vähenemiseen ennen kiteiden tunnistamista. Reportterin aktiivisuus väheni metyleenisinisen vaikutuksesta, kun sitä ohjasi NLRP3-promoottori, jossa oli kaksi NF-kB:n sitoutumiskohtaa. Lyhennetty promoottori, josta nämä kohdat puuttuivat, ei sen sijaan reagoinut. Soluttomassa koeputkessa metyleenisininen vähensi myös suoraan ihmisen rekombinantin kaspaasi-1:n aktiivisuutta. Yhdisteen lisääminen vain esivirityksen tai vain aktivaation aikana vähensi silti IL-1betan, IL-18:n ja kaspaasi-1:n vapautumista, joten vaikutus koskee molempia vaiheita.

Hiirikokeet vastasivat tätä valikoivuutta. Tappava lipopolysakkaridiannos tappoi verrokkieläimet muutamassa tunnissa, kun taas metyleenisininen paransi eloonjäämistä. Vatsaontelon IL-1beta väheni, mutta saman nesteen IL-6 ei. Listerian aiheuttaman vatsakalvotulehduksen mallissa vatsaontelon IL-1beta väheni, mutta solujen kokonaismäärä ei muuttunut. Ihmisen THP-1-monosyytit käyttäytyivät hiiren makrofagien tavoin kaikissa neljässä inflammasomityypissä. Inflammasomia koskeva tulos selittää IL-1betan ja IL-18:n kypsymistä, ei kaikkia sytokiineja. Siksi myös aivojen immuunisolujen muoto mikroglia- ja astrosyyttikokeissa vastaa eri kysymykseen kuin proteiinirungon kokoaminen.

Reitti 2: iNOS:n transkriptio NF-kB:n ja STAT1:n sitoutumisen kautta

Indusoituvaa typpioksidisyntaasia eli iNOS:ää on lepotilassa vain vähän, ja sen transkriptio käynnistyy tarvittaessa. Lipopolysakkaridi käynnistää sen pääasiassa IkB-alfan hajoamisen kautta, jota seuraavat NF-kB:n fosforylaatio ja siirtyminen tumaan. Interferoni-gamma käynnistää sen pääasiassa Janus-kinaasin välittämän STAT1:n fosforylaation kautta, jota seuraa STAT1:n siirtyminen tumaan. Kumpikin tekijä sitoutuu sitten omaan kohtaansa iNOS-promoottorissa. Entsyymiaktiivisuus ja geenin induktio ovat erillisiä säätelykohtia, ja lääkeaine voi vaikuttaa kumpaan tahansa tai molempiin.

Vuoden 2015 tutkimus iNOS:n induktiosta makrofageissa ja endotokseemisissa hiirissä paikansi vaikutuksen lähetti-RNA:n tasolle. RAW 264.7 -soluissa ja hiiren primaarisissa makrofageissa metyleenisininen pitoisuudella 1 micromolar, annettuna 30 minuuttia ennen lipopolysakkaridia, interferoni-gammaa tai molempia, vähensi iNOS-proteiinia ja mRNA:ta 8–24 tunnin aikana. Samalla kasvatusliuoksen nitriittipitoisuus pieneni eikä solujen elinkyky heikentynyt. Hiirissä, joille annettiin lipopolysakkaridia 25 mg per kg, tuntia aiemmin annettu yksittäinen metyleenisinisen annos 5 mg per kg vähensi iNOS-proteiinia ja mRNA:ta keuhkoissa, maksassa ja sydämessä.

Erottava yksityiskohta on se, mikä ei muuttunut. IkB-alfan hajoaminen, NF-kB:n fosforylaatio, STAT1:n fosforylaatio ja kummankin tekijän kertyminen tumaan säilyivät ennallaan. Katkos tuli yhtä vaihetta myöhemmin: tumauutteissa havaittiin lipopolysakkaridin jälkeen vähemmän NF-kB:n sitoutumista sen DNA-elementtiin ja interferoni-gamman jälkeen vähemmän STAT1:n sitoutumista. Kromatiinin immunosaostus vahvisti, että kumpaakin tekijää oli vähemmän sitoutuneena iNOS-promoottoriin solujen sisällä. Myös tuumorinekroositekijä alfa, jonka promoottori käyttää NF-kB:tä, väheni. Tekijät aktivoituivat ja saapuivat tumaan, mutta sitoutuivat heikosti kohde-DNA:hansa.

Huomaa ero reittiin 1. Tässä on kyse tekijän sitoutumisesta DNA:han, mukana on STAT1 eikä STAT3, ja mitattavia vasteita ovat mRNA, proteiini ja nitriitti ASC-täplien ja kaspaasi-1-fragmenttien sijaan. Karttamme metyleenisinisen kohteista eri solumalleissa pitää tämän transkriptiotason erillään suorista entsyymi- ja mitokondriomittauksista.

Reitti 3: seerumin IL-6 ja kudosten STAT3-aktivaatio

IL-6 välittää signaaleja gp130-reseptoriperheen kautta Janus-kinaasi–STAT3-kaskadiin. Fosforyloitunut STAT3 muodostaa dimeerejä, siirtyy tumaan ja käynnistää tulehdukseen liittyviä ohjelmia. IL-6 itse on NF-kB:n kohde, joten nämä muodostavat palautesilmukan, jota kutsutaan usein IL-6–STAT3-akseliksi. Tavallisia mitattavia vasteita ovat reitin alkuvaiheen seerumin IL-6, fosforyloituneen STAT3:n suhde kokonais-STAT3:een sekä myöhempien vaiheiden efektorientsyymit, kuten iNOS ja COX2.

Vuoden 2023 hiiritutkimus IL-6:sta ja STAT3:sta lipopolysakkaridin annon jälkeen mittasi akselia eri näytteissä ja kudoksissa. C57BL/6-uroshiirille annettiin lipopolysakkaridia 1 mg per kg päivittäin kolmen päivän ajan ja metyleenisinistä 5 tai 10 mg per kg 30 minuuttia kunkin annoksen jälkeen. Kolmantena päivänä seerumin IL-6 oli molemmissa metyleenisiniryhmissä pienempi kuin pelkkää lipopolysakkaridia saaneessa ryhmässä, kun taas useimmat muut mitatut sytokiinit eivät muuttuneet käsittelyn vaikutuksesta. Fosforyloituneen STAT3:n suhde kokonais-STAT3:een oli pienempi aivokuoressa, hippokampuksessa ja korvan ihossa. Lisäksi mikroglian Iba-1-värjäytyminen oli vähäisempää, iNOS- ja COX2-tasot olivat pienemmät ja painon lasku lieveni osittain.

Tässä on syytä huomioida kaksi varausta. Pienempi seerumin IL-6 yhdessä vähäisemmän kudosten STAT3-fosforylaation kanssa sopii akselin muuntumiseen, mutta ei yksilöi ensisijaista vaikutuskohtaa. Reitin alkuvaiheen sytokiinin väheneminen, reseptorisignaloinnin väheneminen tai fosfataasiaktiivisuuden muuttuminen voisivat kukin tuottaa saman suhteen. Lisäksi paino kolmen päivän akuutin altistuksen aikana on koko eläimen tason mittari, ei oire- tai remissiopistemäärä. Se antaa proteiiniblottia laajempaa taustatietoa muuttamatta signalointitulosta hoitoväitteeksi. Mitokondrioiden redox-prosessien erillinen kemia etenee tämän sytokiinikokonaisuuden rinnalla, eikä niitä pidä yhdistää toisiinsa.

Reittien vertailu: vaikutuskohdat ja mitattavat vasteet

Taulukko estää kolme perusteetonta päätelmää. ASC-täpliä koskeva tulos ei todista STAT3:a koskevaa tulosta. STAT1:n sitoutuminen iNOS-promoottoriin ei todista STAT3:a koskevaa tulosta, vaikka molemmat proteiinit kuuluvat STAT-perheeseen. Seerumin IL-6:ta koskeva tulos ei todista inflammasomin kokoamisen vähenemistä: vatsaontelokokeessa IL-1beta väheni, mutta IL-6 ei. Jokainen rivi tarvitsee oman käynnistäjänsä ja mitattavan vasteensa. Siksi metyleenisinistä koskevia solu-, eläin- ja kliinisiä tutkimuksia luettaessa jokainen väite on sovitettava siihen tasoon, jolla se mitattiin.

Mikään tästä ei osoita annostusta, turvallisuutta tai hyötyä ihmisillä. Lipopolysakkaridimallit ovat hallittuja ärsykkeitä mekanismin testaamiseen, eivät kroonisten sairauksien jäljitelmiä. Aineen antaminen ärsykkeen yhteydessä testaa aiheutetun muutoksen ehkäisyä, ei jo kehittyneen sairauden kumoamista. Pidä tämä mekanismien kuvaus erillään potilaiden hoitotuloksista ja arvioi jokainen terveysväite sen taustalla olevan potilastutkimuksen perusteella.