Hiivan metyleenisin testit: elävien solujen laskenta ja soluhengityksen ajoitus

Työpöydällä on kaksi putkea. Molemmat ovat sinisiä. Toisessa mikroskoopilla näkyvät siniset solut merkitsevät kuollutta hiivaa. Toisessa putken muuttuminen sinisestä värittömäksi merkitsee, että hiiva on elossa ja hengittää. Sama väriaine, vastakkaiset tulkinnat. Jos sekoitat nämä kaksi testiä keskenään, jokainen päätelmä kääntyy päälaelleen.

Tämä ero on koko artikkelin ydin. Metyleenisininen on hapetus-pelkistysväriaine: hapettuneena se on sinistä, pelkistyneenä väritöntä leukometyleenisinistä. Elinkyvyn laskenta hyödyntää tätä kemiaa lyhyessä mikroskooppisessa tilannekuvassa. Soluhengityskoe hyödyntää sitä koko näytteen ajastetussa reaktiossa. Kumpikin tarvitsee oman menetelmänsä, omat kontrollinsa ja oman kriittisen tarkastelunsa.

Elinkyvyn laskenta: lyhyt värjäys, nopea tarkastelu

Panimokäytössä oleva menetelmä on standardoiduin versio. Valmista 0.01% w/v metyleenisiniliuos 2% natriumsitraattiin, sekoita sitä hiivasuspensioon suhteessa 1:1 ja tarkastele seosta lyhyen, vakioidun ajan kuluttua. Julkaistut ajat vaihtelevat Brewing Science Instituten käsikirjan 1–2 minuutista tutkimusmenetelmien noin 5 minuuttiin, ja OIV:n viinimikrobiologinen menetelmä edellyttää tarkastelua 10 minuutin kuluessa. Laskentaseoksen väriainepitoisuudeksi tulee noin 0.005%. Täytä parannettu Neubauer-laskentakammio ja luokittele noin 400x suurennuksella tummansiniset solut elinkyvyttömiksi ja värjäytymättömät solut elinkykyisiksi. OIV:n menetelmässä vaaleansiniset solut luokitellaan eläviksi, mikä jo viittaa jäljempänä käsiteltävään subjektiivisuusongelmaan.

Solupitoisuus saadaan laskentakammion geometriasta. Kun koko keskimmäinen 1 mm:n neliö lasketaan, solujen määrä per mL on N kertaa laimennuskerroin kertaa 10^4, missä N on kyseiseltä alueelta laskettu solumäärä, kuten ASBC:n hiivamenetelmissä kuvataan. Elinkyky on yksinkertaisempi laskea: värjäytymättömien solujen määrä jaettuna kaikkien solujen määrällä, kerrottuna 100:lla. Laske elinkykyarviota varten noin 400 solua FEMS:n panimomenetelmien vertailututkimuksen ja OIV:n käytännön mukaisesti. Käytä johdonmukaisesti yhtä rajaviivasääntöä: esimerkiksi ota mukaan ala- ja vasemmalla ruudukkoviivalla olevat solut ja jätä pois ylä- ja oikealla viivalla olevat.

Silmujen laskentasääntö on määriteltävä ennen laskennan aloittamista. Yleisen käytännön mukaan silmu lasketaan erilliseksi soluksi, kun se on noin puolet emosolun koosta, ja sitä pienempi silmu lasketaan yhdessä emosolun kanssa. Valitusta säännöstä riippumatta sovella sitä jokaiseen ruutuun ja kirjaa se lomakkeeseen, jotta seuraava henkilö voi toimia samoin.

Laskentalomake (tulosta tämä)

Tämä lomake on laadittu tätä artikkelia varten. Kopioi se muistikirjaan tai tulosta yksi lomake jokaista näytettä varten.

Elinkyky (%) = 100 x värjäytymättömät / (värjäytymättömät + tummansiniset). Solujen kokonaismäärä per mL = N x laimennuskerroin x 10^4, missä N saadaan määritellyltä laskentakammion alueelta. Kirjaa värjäysaika tuloksen viereen, sillä elinkykyarvo ilman siihen liittyvää ajoitusta ei ole toistettavissa.

Miksi elinkykyarvot vaihtelevat

Ajoitus on ensimmäinen häiriötekijä, ja se vaikuttaa molempiin suuntiin. Aineenvaihdunnallisesti aktiiviset solut pelkistävät väriainetta, joten liian aikainen tarkastelu voi osua hetkeen, jolloin elävät solut eivät ole vielä saaneet pelkistymistä valmiiksi, ja ne luokitellaan virheellisesti kuolleiksi. Pitkä altistus on kuitenkin itsessään myrkyllinen ja tuottaa aidosti vaurioituneita sinisiä soluja, jolloin värjäys antaa virheellisen kuolleisuustuloksen. Siksi eräs laboratorio-opetuksen menetelmä edellyttää luokittelua 5 minuutin kuluessa, kuten Wisconsinin hiivan opetusmenetelmässä todetaan. Varovainen muotoilu on, että metyleenisiniseen perustuva luokittelu riippuu ajasta: valitse siis yksi lyhyt aikaväli ja pidä se samana sarjan jokaisessa näytteessä.

Näytteisiin, joiden elinkyky on heikko, liittyy toinen harha. Standardoitu menetelmä varoittaa, että metyleenisininen voi yliarvioida todellisen elinkyvyn sen ollessa alle noin 80%, koska väriainetta edelleen pelkistävät solut eivät välttämättä ole enää lisääntymiskykyisiä. Panimokirjallisuus kuvaa samaa epäluotettavuutta tilanteissa, joissa elinkyky on heikentynyt huomattavasti. Pidä metyleenisinistä nopeana, likimääräisenä arviona ja varmista kriittiset heikkoon elinkykyyn liittyvät päätökset, kuten viljelmän käyttö uudelleen hiivaukseen, maljaviljelyn pesäkelaskennalla tai täydentävällä värjäyksellä.

Kolmantena tulevat näytematriisin vaikutukset. OIV:n menetelmä toimii lähellä pH-arvoa 4.6 ja varoittaa, että voimakkaasti puskuroidut, matalan pH:n näytteet estävät väriaineen asianmukaisen toiminnan. Menetelmää ei myöskään suositella yli 100 g/L sokeripitoisuuksilla, jolloin solut näyttävät harhaanjohtavan vaaleansinisiltä. Värjäyksen pH-arvojen kokeellisessa vertailussa herkkyys muuttui huomattavasti tutkitulla alueella, mikä vastaa metyleenisinimenetelmän pH-riippuvuutta käsittelevän tutkimuksen havaintoja. Jätehiukkaset ovat erillinen sudenkuoppa: epäpuhtaiden mäskien värjäytyneet hiukkaset muistuttavat kuolleita soluja ja lisäävät laskijoiden välisiä eroja.

Tämä vaihtelu on mitattu, eikä kyse ole vain yksittäisistä havainnoista. FEMS:n hiivamenetelmien vertailussa raportoidussa kuuden kuukauden panimokokeessa metyleenisinisen rinnakkaismittausten keskihajonta oli keskimäärin 6.1%, kun oksinolilla tehdyssä virtaussytometriassa se oli 0.2%. Kahden laskijan tulokset erosivat samasta näytteestä jopa 13 prosenttiyksikköä. Vuoden 2023 elinkykymenetelmien määrällisessä vertailussa fluoresenssimikroskopia ja virtaussytometria osoittautuivat huomattavasti tarkemmiksi, mutta samalla havaittiin, että menetelmien suorituskyky riippuu lajista ja näytematriisista. Paintingin ja Kirsopin klassinen menetelmäkuvaus (PMID 24430080) toimii edelleen vertailukohtana, ja laajempi katsaus hiivan elinkyky- ja elinvoimaisuustesteihin (PMID 25154541) sijoittaa metyleenisinisen täydentävien, ei ratkaisevien testien joukkoon. Trypaanisininen ei ole tässä automaattisesti parempi vaihtoehto: se kertoo solukalvon eheyden menetyksestä, kun taas metyleenisininen kertoo väriaineen sisäänotosta ja pelkistysaktiivisuudesta. Siksi kuormittuneet solut voivat saada eri luokituksen näillä kahdella väriaineella.

Soluhengityskoe: mittaa sinisen värin häviämiseen kuluva aika

Toisessa testissä ei käytetä mikroskooppia lainkaan. Hiiva, glukoosi ja laimea metyleenisininen pannaan suljettuun putkeen, ja kellolla mitataan, kuinka kauan sinisen värin häviäminen kestää. Solujen aineenvaihdunta tuottaa pelkistäviä ekvivalentteja, jotka muuttavat sinisen väriaineen värittömään muotoon, kun taas liuennut happi hapettaa sen takaisin. Kun solut kuluttavat happea, pelkistyminen alkaa hallita nettoreaktiota ja putken väri häviää. Päätepiste kuvastaa siis soluhengityksen, väriainepitoisuuden ja hapen saatavuuden tasapainoa. Se tulee ilmoittaa metyleenisinisen pelkistymis- tai värin häviämisaikana, ei suorana molekulaarisen hapen kulutusnopeutena.

Käytä paljon laimeampaa väriainetta kuin elinkyvyn määrityksessä, jotta mitattava aika osuu sopivalle alueelle. AQA:n A level -tutkinnon pakollisten käytännön töiden käsikirja vakioi tämän hyvin: 1 g glukoosia 100 mL:aan noin 30 C:seen lämmitettyä vettä, 5 g kuivahiivaa lisättynä juuri ennen käyttöä sekä noin 0.001% käyttöliuos, joka valmistetaan laimentamalla 0.1 mL 1% kantaliuosta tilavuuteen 100 mL. Sekoita 2 mL hiiva-glukoosisuspensiota ja 2 mL väriaineen käyttöliuosta, anna lämpötilan tasaantua koelämpötilaan, ravista kerran 10 sekuntia, käynnistä ajanotto äläkä ravista uudelleen. Ravistaminen tuo näytteeseen lisää happea ja palauttaa putken sinisen värin; tämä on suurin yksittäinen menetelmästä johtuva artefakti. AQA:n mukaan valmisteen värin pitäisi tavallisesti hävitä noin 5 minuutissa lämpötilassa 35 C. Kokeiden keskiarvot olivat 275 s lämpötilassa 20 C, 128 s lämpötilassa 35 C ja 145 s lämpötilassa 45 C. Nämä ovat yhden koejärjestelyn esimerkkejä, eivät yleispäteviä vertailuarvoja. Pelkistymisnopeuden ja aineenvaihdunnallisesti aktiivisen hiivan määrällistä yhteyttä kontrolloiduissa olosuhteissa tukevat sitä käsittelevät tutkimukset, kuten tunnisteella PMID 25773544 indeksoitu työ ja mekanismeja tarkasteleva tutkimus julkaisussa Yeast (2014).

Aikasarjaesimerkki (artikkelia varten laadittu aineisto)

Alla oleva taulukko on tätä artikkelia varten laadittu esimerkki, joka käyttää edellä kuvattua AQA-tyyppistä koejärjestelyä: 2 mL hiiva-glukoosiseosta ja 2 mL noin 0.001% väriaineen käyttöliuosta, yksi 10 sekunnin ravistus ja sen jälkeen inkubointi häiritsemättä. Arvot ovat esimerkkilukemia siinä muodossa, jossa opiskelijaryhmän tulisi ne kirjata. Nopeusindeksi määritellään jakamalla 1 värin häviämiseen kuluvalla ajalla sekunteina. Tee koe samoilla putkilla ja korvaa nämä arvot mitatuilla tuloksilla.

Piirrä putkien A, B ja C nopeusindeksi lämpötilan funktiona. Käyrä nousee ja sitten tasoittuu tai laskee, mikä vastaa odotettua entsyymitoiminnan ohjaamaa käyttäytymistä, ei suoraa viivaa. Putket D, E ja F eivät ole tämän käyrän datapisteitä. Ne ovat kontrollit, joiden avulla käyrää voidaan tulkita.

Kontrollit, jotka tekevät kummastakin testistä merkityksellisen

Jokainen soluhengityskoe tarvitsee kolme rinnakkaista kontrollia. Keitetyn tai tapetun hiivan, glukoosin ja väriaineen seoksen pitäisi pysyä sinisenä, mikä osoittaa nopean pelkistymisen riippuvan elävästä aineenvaihdunnasta. Elävä hiiva ja väriaine ilman lisättyä glukoosia muodostavat substraattikontrollin, mutta odota silti hidasta värin häviämistä, sillä hiiva kuluttaa solunsisäisiä varastojaan. Glukoosi ja väriaine ilman hiivaa muodostavat kemiallisen nollanäytteen, joka on välttämätön, koska glukoosi voi emäksisissä olosuhteissa pelkistää metyleenisinistä ilman soluja.

Elinkykyä määrittävä laskenta tarvitsee toisenlaista kontrollia: menettelyn vakiointia. Sama väriaineen kantaliuos, sama sekoitussuhde, sama värjäysaika, sama laskentakammion alue, samat silmujen laskenta- ja rajaviivasäännöt sekä mahdollisuuksien mukaan sokkoutettu laskenta. Kun kahden laskijan tulokset eroavat kymmenen prosenttiyksikköä, lomake paljastaa yleensä syyn: eri ajoitus, eri kynnys siniseksi luokittelulle tai eri silmujen laskentasäännöt. Värjättyjen solujen valmistelu- ja tarkastelutekniikat liittyvät bakteerien yksinkertaisiin värjäysmenetelmiin, ja laajempi katsaus siihen, mitä väriaine merkitsee eri näytteissä, löytyy mikroskooppisten värjäysten atlaksesta. Sinisen värin voimakkuuden määrällisen tulkinnan fysiikkaa käsittelevä, olosuhdetiedoilla varustettu absorptioviite selittää, miksi jokaisen kertoimen mukana on ilmoitettava sen liuotin-, pH- ja pitoisuusolosuhteet.

Valitse testi kysymyksen perusteella. Kuinka monta solua on juuri nyt elossa, on laskentakysymys, johon vastataan mikroskoopilla ja laskentalomakkeella. Kuinka aktiivisesti tämä viljelmä hengittää, on kineettinen kysymys, johon vastataan sekuntikellolla ja kontrolloiduilla koeputkilla. Metyleenisininen palvelee molempia tarkoituksia, mutta ei koskaan samassa putkessa samaan aikaan.