Metyleenisininen G6PD-laboratoriotesteissä: mitä väriaine oikeastaan tekee

Opiskelija tarkastelee kahta koeputkea inkuboinnin jälkeen. Toinen on muuttunut odotetun väriseksi. Toinen ei. Opiskelija päättelee, että toisella potilaalla on glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin puutos. Päätelmä voi olla oikea, mutta päättelystä jää pois testin toiminnan kannalta keskeinen asia. Mikään koeputkessa ei mittaa entsyymiä suoraan. Koeputkessa mitataan sitä, mitä entsyymi tuottaa, ja metyleenisininen toimii välittäjänä.

Kun tämä epäsuora mittaustapa on selvä, menetelmä, kontrollit ja pitkä luettelo virheellisistä tuloksista eivät enää vaikuta mielivaltaisilta.

Lyhyt vastaus

Metyleenisininen on G6PD-testauksessa redox-indikaattori. G6PD-entsyymi tuottaa NADPH:ta, ja NADPH-riippuvaiset järjestelmät pelkistävät sinisen metyleenisinisen sen värittömäksi leukomuodoksi tai käyttävät sitä elektronien siirtämiseen. Normaali entsyymiaktiivisuus johtaa tehokkaaseen pelkistymiseen. Puutteellinen aktiivisuus johtaa hitaaseen tai epätäydelliseen pelkistymiseen. Siinä on koko mittaussignaali.

Kahdessa historiallisessa menetelmässä käytetään samaa väriainetta, mutta niiden päätepisteet eroavat toisistaan. Kun menetelmät pitää erillään, suurin osa sekaannuksista katoaa.

Kaksi testiä, yksi väriaine, eri päätepisteet

Ensimmäinen on suora metyleenisinisen pelkistymistesti, jonka Sass ja hänen kollegansa kuvasivat ja jota Gibbs myöhemmin arvioi. Tässä päätepisteenä on itse väriaine: hapettunut sininen metyleenisininen pelkistyy kohti väritöntä leukometyleenisinistä, ja muutoksen nopeus kuvastaa NADPH:n tuotantokapasiteettia. Alkuperäinen seulontatutkimus on indeksoitu PubMediin nimellä Sass ym. (1966).

Toinen on Brewerin methemoglobiinin pelkistymistesti. Natriumnitriitti hapettaa ensin hemoglobiinin ruskeaksi methemoglobiiniksi. Metyleenisininen toimii sitten elektroninsiirron välittäjänä: pelkistynyt metyleenisininen siirtää pelkistysekvivalentteja methemoglobiinille ja muuttaa sen takaisin punaiseksi hemoglobiiniksi. Näkyvä päätepiste on siis ruskea tai punainen, ei sininen tai väritön. Alkuperäinen menetelmä julkaistiin Bulletin of the World Health Organization -lehdessä (Brewer ym., 1960).

Brewerin määrityksen kutsuminen väriaineen värin häviämiseen perustuvaksi testiksi on kemiallisesti epätarkkaa. Väriaine kiertää eri muotojen välillä; hemoglobiini muuttaa väriään. Alla oleva kaavio kuvaa molemmat reaktioreitit.

Taustalla oleva reaktio

G6PD katalysoi pentoosifosfaattireitin ensimmäistä hapetusvaihetta:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Kypsät punasolut ovat NADPH:n saannissaan vahvasti riippuvaisia tästä reitistä, kuten Luzzatton ja hänen kollegoidensa katsauksessa Blood-lehdessä (2020) kuvataan. NADPH pitää glutationin pelkistyneenä ja suojaa solua hapettumisvaurioilta. Metyleenisininen liittyy tähän järjestelmään elektronien vastaanottajana. Riittävä G6PD-aktiivisuus tuottaa riittävästi NADPH:ta, mikä mahdollistaa tehokkaan pelkistymisen. Vähäinen G6PD-aktiivisuus katkaisee ketjun sen ensimmäisestä lenkistä.

Ajattele väriainetta polttoainemittarina, älä moottorina. Se kertoo NADPH:n saatavuudesta. Mikä tahansa muu tekijä, joka muuttaa saatavuutta tai tuloksen lukemista, voi liikuttaa mittarin viisaria ilman geenissä tapahtuvaa muutosta.

Miten Brewer-tyyppinen menetelmä toteutetaan

Reagenssikoostumukset ovat vaihdelleet vuosikymmenten aikana, joten opetuskäyttöön tarkoitettua kuvausta ei pidä sekoittaa kliiniseen työohjeeseen. Jokainen laboratorio noudattaa omaa validoitua vakiotoimintamenettelyään. Tämä varaus huomioiden perinteinen koeputkimenetelmä toimii seuraavasti. Kolmeen koeputkeen ja 3 tunnin inkubointiin perustuva toteutus on kuvattu tässä julkaistussa menetelmässä:

1. Potilasnäyteputki: kokoverta sekä glukoosia, natriumnitriittiä ja metyleenisinistä. Nitriitti muodostaa methemoglobiinia, glukoosi ylläpitää punasolujen aineenvaihduntaa ja väriaine toimii NADPH-riippuvaisena elektroninsiirtäjänä.
2. Hapettunut kontrolli: verta sekä nitriittiä ja glukoosia, mutta ei metyleenisinistä. Se näyttää ruskean methemoglobiinipäätepisteen eli puutokseen viittaavan värin.
3. Hemoglobiinikontrolli: verta ja vettä. Se näyttää punaisen hemoglobiinipäätepisteen eli normaalin värin.
4. Inkuboi kaikkia putkia lähellä lämpötilaa 37 C, tavallisesti 3 tuntia, sekoittaen varovasti.
5. Laimenna pieni osanäyte kustakin putkesta tislattuun veteen, jotta solut hajoavat ja värivertailu on selkeä.
6. Vertaa potilasnäyteputkea kahteen kontrolliin. Värin palautuminen kohti punaista kertoo huomattavasta pelkistyskapasiteetista. Ruskean värin säilyminen viittaa merkittävään puutokseen.

Eräässä historiallisessa koostumuksessa käytettiin noin 1 mL verta ja reagensseja, joiden pitoisuudet olivat noin 180 mM natriumnitriittiä, 280 mM dekstroosia ja 0.4 mM metyleenisinistä. Pidä näitä lukuja kirjallisuudesta poimittuna esimerkkinä, älä yleispätevänä määritysohjeena.

Tuloksen lukeminen

Laadullinen seulonta erottelee parhaiten aktiivisuustasoja, jotka ovat noin 30–40 prosenttia normaalista, kuten tässä G6PD-puutoksen havaitsemisen katveita käsittelevässä Malaria Journal -katsauksessa todetaan. Normaali seulontatulos tarkoittaa siis, ettei määritys havainnut vaikeaa puutosta. Se ei vahvista aktiivisuuden olevan täysin normaali.

Miksi seulonta voi johtaa harhaan

Hemolyysin jälkeinen retikulosytoosi on tyypillinen virheellisesti normaalin tuloksen syy. Nuorissa punasoluissa ja retikulosyyteissä on enemmän G6PD:tä kuin vanhoissa soluissa. Akuutin hemolyysin aikana vanhimmat solut, joissa puutos on suurin, voivat olla jo tuhoutuneet. Jäljelle jää nuori solupopulaatio, jonka aktiivisuus näyttää testissä normaalilta. Sama biologinen ilmiö johtaa harhaan myös kvantitatiivisissa määrityksissä, ei vain väriaineeseen perustuvissa seulonnoissa.

Äskettäinen verensiirto peittää puutoksen, koska luovuttajan punasolut tuovat näytteeseen oman entsyyminsä. Mayo Clinic Laboratories mainitsee verensiirron yhtenä epäluotettavien entsyymitulosten syynä retikulosytoosin ja leukosyyttien aiheuttaman häiriön ohella.

Heterotsygoottiset naiset ovat vaikein ryhmä. Satunnainen X-kromosomin inaktivaatio tuottaa sekoituksen normaaleja ja G6PD-puutoksisia punasoluja, ja kokonaisaktiivisuus voi sijoittua mihin tahansa vaikean puutoksen ja näennäisesti normaalin välille. Laadullisissa seulonnoissa välimuotoiset fenotyypit jäävät usein havaitsematta. WHO:n G6PD-testausta koskevassa dokumentaatiossa tätä rajoitusta käsitellään yksityiskohtaisesti.

Näytteen ikä, säilytyslämpötila, silmämääräisen päätepisteen subjektiivisuus, hematokriitti ja reagenssien laatu lisäävät analyyttistä vaihtelua näiden biologisten vaikutusten lisäksi.

Seulonta ei ole diagnoosi

Puutokseen viittaava, välimuotoinen tai kliinisten havaintojen kanssa ristiriitainen seulontatulos edellyttää kvantitatiivista G6PD-entsyymimääritystä. WHO pitää lämpötilakontrolloitua kvantitatiivista spektrofotometriaa vertailumenetelmänä. Tässä määrityksessä punasoluhemolysaattiin lisätään glukoosi-6-fosfaattia ja NADP+:aa, ja muodostuvaa NADPH:ta seurataan absorbanssin kasvuna aallonpituudella 340 nm. Muutosnopeus on verrannollinen entsyymiaktiivisuuteen, joka yleensä suhteutetaan hemoglobiiniin ja ilmoitetaan yksikköinä grammaa kohti. Nykyinen kliininen laboratoriokäytäntö on tiivistetty Mayon tutkimusluettelon G6PD-aktiivisuutta käsittelevässä kohdassa.

Tulkinnassa käytetään laboratorion validoitua viitealuetta, joka ilmaistaan usein suhteessa väestön normaaliin aktiivisuuteen. Puutoksesta puhutaan tavallisesti noin 30 prosentin raja-arvon yhteydessä ja välimuotoisesta aktiivisuudesta sen yläpuolella. WHO:n G6PD-testien tavoitetuoteprofiilit (2022) kuvaavat tämän diagnostisen viitekehyksen. Jos äskettäinen hemolyysi tai verensiirto tekee fenotyypin määrittämisestä epäluotettavaa, testaus toistetaan punasolupopulaation tasapainotuttua uudelleen. Molekyylitutkimus voi antaa lisätietoa, mutta se ei korvaa entsyymiaktiivisuuden mittausta.

Raja, joka kannattaa pitää selvänä

Näissä määrityksissä metyleenisininen on ex vivo -laboratorioreagenssi. Tämä on eri asia kuin metyleenisinisen potilaalle antamisen turvallisuus, jota käsitellään metyleenisinisen vasta-aiheita koskevassa ohjeistuksessa. Biokemia yhdistää nämä aiheet, sillä myös lääkeaineen toiminta riippuu NADPH-riippuvaisesta pelkistymisestä. Väriaine koeputkessa ei kuitenkaan ole sama asia kuin annos verenkierrossa. Lisätietoa väriaineen toiminnasta värjäysaineena toisessa käyttöympäristössä on artikkelissa metyleenisinivärjäyksen periaatteet. Sen kemiallista ryhmää käsitellään aiheessa redox-väriaineet laboratoriossa.

Seulonnassa kysytään, näyttääkö pelkistyskapasiteetti säilyneen. Varmistuksessa kysytään, kuinka paljon entsyymiä todella on. Väriaine vastaa ensimmäiseen kysymykseen hyvin, kunhan sitä ei pyydetä vastaamaan toiseen.