Metyleenisininen ja ALS: miksi tulokset vaihtelevat kokeellisten mallien välillä

Kun haet tietoa metyleenisinisestä ja ALS:stä, löydät kaksi väitettä, jotka näyttävät olevan ristiriidassa. Toisen mukaan sininen väriaine suojasi hermosoluja ALS-malleissa. Toisen mukaan se ei vaikuttanut lainkaan ALS-hiirimallissa. Molemmat väitteet viittaavat todellisiin tutkimusartikkeleihin, ja molemmat artikkelit kannattaa ottaa vakavasti. Ristiriita ratkeaa, kun täsmennetään kunkin kokeen taustalla oleva periaate: malli määrittää väitteen.

Madosta saatu tulos koskee matoa. Kalan toukasta saatu tulos koskee kalan toukkaa. Kumpikaan ei koske potilasta, ennen kuin nisäkkään taudinkulkua koskeva näyttö tukee sitä. Tässä artikkelissa vertaillaan rinnakkain kahta eniten viitattua tutkimusartikkelia, jotta näet, miksi niiden vastaukset eroavat.

Kaksi koetta yhdessä taulukossa

Pidä tämä taulukko esillä lukiessasi. Kaikki tutkimusten tärkeät erot mahtuvat siihen.

Genetiikka, lajit, annostelureitti, ajoitus ja päätetapahtumat eroavat. Genotyyppi on vain yksi viidestä erosta, joten tämä tutkimuspari ei voi osoittaa, että metyleenisininen vaikuttaisi valikoivasti yhteen ALS:n mekanismiin. Se osoittaa jotain rajatumpaa mutta silti hyödyllistä: varhaisella suoralla altistuksella saavutettu voimakas korjaantuminen yksinkertaisissa malleissa ei siirtynyt nisäkkään taudinkulkuun pitkäaikaisessa suun kautta annostelussa.

Myönteinen tulos: mitä mato- ja kalatutkimus osoitti

Vuoden 2012 mato- ja kalatutkimuksessa matojen liikehermosolut saatiin ilmentämään mutanttia ihmisen TDP-43:a tai FUS:ia, ja kalan alkioihin injektoitiin mutanttia ihmisen mRNA:ta. Nämä ovat proteotoksisuuden malleja. Ne jäljittelevät mutanttiproteiinin toksisia vaikutuksia liikkumiseen ja hermosolujen muotoon päivien aikana, eivät aikuisen ihmisen ALS:n koko vuosia kestävää taudinkulkua.

Käsittely aloitettiin hyvin varhain. Madot kasvoivat metyleenisinistä sisältävällä agarilla kuoriutumisesta lähtien. Kalan alkiot olivat lääkeaineliuoksessa yön yli alkaen 24 tunnin kuluttua hedelmöityksestä, ja käyttäytymistä testattiin noin kaksi päivää myöhemmin. Lääkeaineen ja hermosolun välissä ei ollut veri-aivoestettä samalla tavoin kuin nisäkkäällä, eikä lääkeainepitoisuutta plasmassa tai aivoissa mitattu.

Näissä olosuhteissa vaikutukset olivat suuria ja johdonmukaisia. Sekä 6 että 60 μM vähensivät ikään liittyvää halvaantumista TDP-43- ja FUS-madoissa. Aikuisvaiheen päivänä 12 noin 80 prosenttia käsittelemättömistä TDP-43-madoista oli halvaantunut, kun kuoriutumisesta lähtien käsitellyistä madoista osuus oli noin 10 prosenttia. Synaptinen määritys viittasi samaan suuntaan: TDP-43-madot olivat yliherkkiä aldikarbille, hermo-lihasliitoksen viestinvälitystä tutkivalle lääkeaineelle, ja metyleenisininen siirsi vastetta takaisin kohti normaalia. Rappeutuvien liikehermosolu-ulokkeiden määrä väheni, ja selvin vaikutus havaittiin pitoisuudella 60 μM. Kaloissa kosketuksen laukaisema uinti parani huomattavasti, ja lyhentyneet motoriset aksonit kasvoivat takaisin kohti normaalia pituutta pitoisuuksilla 30 tai 60 μM, vaikka korjaantuminen oli osittaista eikä täydellistä.

Oksidatiivista stressiä koskevat tiedot sopivat antioksidanttivaikutukseen perustuvaan tulkintaan. Mutanttimadoilla ja -kaloilla reaktiivisia happiyhdisteitä kuvaavat mittausarvot olivat koholla ja laskivat käsittelyn myötä. Metyleenisiniselle altistetut normaalit madot selvisivät hapettumista edistävästä kuormituksesta paljon pidempään kuin käsittelemättömät madot. Kaksi rajoitusta on kuitenkin olennaisia. Mutanttien TDP-43- ja FUS-proteiinien kokonaismäärät eivät laskeneet, eikä tutkimuksessa mitattu suoraan proteiiniaggregaattien määrää. Se siis osoittaa toiminnallista korjaantumista mutta ei todista aggregaattien poistumista. Redox- ja mitokondriohypoteesien tavanomaisia tulkintoja seuraavan kannattaa pitää mekanismia näyttöä saaneena mutta ei ratkaistuna.

Ajoitus oli havainnollisin yksityiskohta. Kun tutkijat odottivat aikuisvaiheen päivään 5 ennen käsittelyn aloittamista, halvaantuneiden osuus päivänä 12 oli noin 55 prosenttia. Kuoriutumisesta lähtien käsitellyillä osuus oli noin 10 prosenttia. Sama lääkeaine, sama mato, sama mutaatio, mutta paljon pienempi vaikutus. Varhainen ennaltaehkäisevä altistus selitti suuren osan havaitusta hyödystä.

Nollatulos: mitä SOD1-hiiritutkimus osoitti

Vuoden 2011 hiiritutkimuksessa esitettiin vaikeampi kysymys tiukemmassa tutkimusasetelmassa. Kongeenisilla SOD1 G93A -hiirillä tauti etenee takaraajojen vapinasta kävelyn heikkenemiseen ja oikaisurefleksin menetykseen sekä ennalta määriteltyyn lopulliseen päätetapahtumaan. Käsittely alkoi ennen oireita päivänä 45 ja jatkui päivittäin. Havainnoijat pisteyttivät neurologisen tilan asteikolla 0–6. Tässä kokeessa seurattiin koko taudinkulkua, joten se on lähempänä potilaalle merkityksellisiä asioita kuin mikään madon halvaantumista kuvaava käyrä.

Keskeiset tulokset olivat nollatuloksia. Oireet alkoivat kokonaisuutena verrokeilla 121 päivän ja metyleenisinistä saaneilla 124 päivän kohdalla; ero ei ollut merkitsevä. Elossaoloaika loppuvaiheeseen asti oli vastaavasti 167 päivää ja 170 päivää, eikä tämäkään ero ollut merkitsevä. Muutamat toissijaiset osatarkastelut suosivat käsittelyä: naarailla oireiden alku viivästyi noin 7 päivää, ja käsitellyt eläimet viettivät hieman enemmän aikaa lievemmissä vaiheissa ja vähemmän vaikeissa. Sukupuolikohtaiset alaryhmät olivat pieniä ja vaihevertailuja tehtiin paljon, joten näitä havaintoja on pidettävä hypoteeseja synnyttävinä eikä todisteina. Hermosolujen määriä, SOD1:n aggregoitumista tai oksidatiivisia ja tulehduksellisia merkkiaineita ei mitattu. Siksi tutkimus ei myöskään voi kertoa, saavuttiko lääkeaine kohteensa mutta jäi tehottomaksi vai jäikö kohdevaikutus tällä annoksella kokonaan syntymättä. Vain yhtä annosta testattiin.

Tutkijat itse nostivat esiin keskeisimmän rajoituksen, joka pätee molempiin suuntiin. Suuren kopiomäärän SOD1 G93A mallintaa hyvin toksisen SOD1:n aiheuttamaa tautia, mutta SOD1-tauti muodostaa pienen osan perinnöllisestä ALS:stä, ja sen biologia eroaa useimmista sporadisista tapauksista. He ehdottivat ehdokasaineiden testaamista uudelleen TDP-43:een perustuvissa nisäkäsmalleissa. Tämä ehdotus on sittemmin muuttunut monimutkaisemmaksi, sillä mato- ja kalatutkimuksen tekijät toteavat, että erillisessä metyleenisinisen TDP-43-hiiritutkimuksessa motoriset tulokset eivät myöskään parantuneet. Yhdiste voi siis näyttää vahvalta yhdessä TDP-43-järjestelmässä ja tehottomalta toisessa TDP-43-järjestelmässä. Järjestelmä merkitsee yhtä paljon kuin geeni.

Miksi madon tai kalan tilan paraneminen ei osoita hyötyä potilaille

Ajattele kunkin mallin vastaavan eri kysymykseen.

Ensinnäkin biologia eroaa. TDP-43 ja FUS ovat nukleiinihappoja sitovia proteiineja, joilla on näissä yksinkertaisissa järjestelmissä yhteisiä geneettisiä vuorovaikutuksia. SOD1:n toksisuus puolestaan etenee osittain erilaisten välittömien mekanismien kautta. Lääkeaine, joka lievittää yhtä proteotoksista stressiä, ei välttämättä lievitä toista. Onnistuminen alkion yli-ilmentymismallissa ei myöskään välttämättä ennusta onnistumista aikuisen hitaassa hermoston rappeutumisessa, johon liittyvät tulehdus, gliasolujen osallisuus ja koko elimistön heikkeneminen.

Toiseksi altistus eroaa. Jatkuva altistus mikromolaarisille pitoisuuksille kasvatusympäristössä ei ole sama asia kuin suun kautta annostelu. Suolistosta imeytyminen, ensikierron metabolia, plasman proteiineihin sitoutuminen, aivoihin pääsy ja poistuminen elimistöstä vaikuttavat kaikki siihen, miten nielty annos päätyy selkäytimen liikehermosoluun. Kumpikaan tutkimus ei mitannut lääkeainepitoisuuksia hermostossa, joten kummankaan pitoisuuksia ei voi yhdistää toisen tutkimuksen pitoisuuksiin.

Kolmanneksi ajoitus eroaa. Matojen ja kalojen hyödyt riippuivat vahvasti siitä, että käsittely alkoi ennen patologisten muutosten kertymistä. Myös hiirten käsittely alkoi ennen oireita, mikä on tutkimuksen vahvuus. Ihmisillä hoito alkaisi silti lähes aina oireiden alkamisen jälkeen eli vielä myöhemmin. Ennaltaehkäisevä signaali kahden päivän alkiokokeessa on tutkimuksen lähtökohta, ei kliinisen käytön malli.

Neljänneksi päätetapahtumat eroavat. Halvaantuminen 12 päivän kohdalla, aldikarbiherkkyys, aksonien pituus mikrometreinä ja uintimatka ovat proksimaalisia fenotyyppejä eli lähellä tutkittua mekanismia olevia ilmiasuja. Oireiden alkaminen ja elossaoloaika nisäkkäällä kokoavat yhteen kaikki elimistön kompensoivat ja tilannetta monimutkaistavat prosessit. Lääkeaineet muuttavat usein proksimaalisia mittareita muuttamatta elossaoloaikaa. Siksi nisäkästutkimuksissa käytetään tapahtumaan kuluvaa aikaa kuvaavia päätetapahtumia.

Lukijat, jotka haluavat tarkistuslistan seuraavan otsikon arviointiin, voivat hyödyntää artikkelia prekliinisten tutkimusten lukemisesta: selvitä laji, siirtogeeni, annos ja annostelureitti, mitattiinko lääkeainepitoisuuksia, milloin käsittely alkoi suhteessa patologisiin muutoksiin, oliko päätetapahtuma lyhyen aikavälin fenotyyppi vai taudinkulku ja toistuiko vaikutus toisessa laboratoriossa. Metyleenisinistä koskevasta laajemmasta ihmisillä saadusta tutkimusnäytöstä on edelleen tarkistettava, etenikö jokin näistä varhaisista signaaleista kliiniseksi tutkimustiedoksi.

Mitä tämä tarkoittaa potilaille ja perheille

Näistä tutkimusartikkeleista ei seuraa vakiintunutta metyleenisinisen käyttöohjelmaa ALS:ään. Myönteinen tutkimus tukee TDP-43:n ja FUS:n biologiaan liittyvien oksidatiivisten ja synaptisten mekanismien lisätutkimusta. Nollatuloksen antanut tutkimus puhuu sitä vastaan, että pitkäaikaisen suun kautta annostelun tällä altistuksella odotettaisiin muuttavan SOD1-tyyppisen taudin kulkua. Yhdessä ne kuvaavat mallien välisten tulosten epäjohdonmukaisuutta, eivät hoitosuositusta.

Turvallisuutta on arvioitava yhtä maltillisesti kuin tehoa. Hiirillä tehdyt ALS-tutkimukset eivät kerro mitään turvallisesta annostelusta ihmisille. Metyleenisiniseen liittyy todellisia riskejä: hemolyysi G6PD-puutoksessa ja serotoniinitoksisuus yhdessä serotonergisten lääkkeiden kanssa. Epäilty G6PD-puutos, nykyinen masennuslääkkeiden käyttö ja kaikki suunnitellut lääkitysmuutokset kuuluvat lääkärin kanssa keskusteltaviin asioihin. Myös metyleenisinisen yleiset turvallisuustiedot on syytä käydä läpi ennen kuin kukaan toimii laboratoriotutkimusten otsikoiden perusteella.

Ydinviesti mahtuu yhteen lauseeseen. Metyleenisininen korjasi voimakkaasti TDP-43- ja FUS-matojen sekä kalan toukkien fenotyyppejä varhaisessa altistuksessa, mutta pitkäaikaisessa suun kautta annostelussa SOD1-hiiritutkimuksessa se ei käytännössä tuonut hyötyä oireiden alkamisajankohtaan tai elossaoloaikaan. Rehellinen tulkinta on siis mallista riippuva tutkimusnäyttö, joka ei tue käyttöä potilailla.