Kuka kehitti violetin verivärjäyksen? Malachowski, Romanowsky, Giemsa

Eosiini on punaista. Metyleenisininen on sinistä. Kun ne sekoitetaan ja seos levitetään kuivattuun verisivelyyn, osa sivelystä muuttuu violetiksi.

Ei kuitenkaan jokainen osa. Hyvässä valmisteessa valkosolujen tumat värjäytyvät punavioleteiksi, ja malarialoisen sisällä kromatiini saa saman värin, kun taas ympäröivät punasolut pysyvät vaaleanpunaisina ja solulima harmaansinisenä. Violetti auttaa erottamaan solutyypit toisistaan.

Kumpikaan pullo ei sisällä violettia. Väri syntyy vasta, kun metyleenisinisen tietty hajoamistuote kohtaa eosiinin objektilasilla. Vielä 1880- ja 1890-luvuilla kukaan ei tiennyt tämän tuotteen olemassaolosta, saati siitä, mikä se oli. Väriä tavoittelevat ihmiset työskentelivät yksin epäpuhtaiden väriaineiden kanssa, eikä heillä ollut luotettavaa tapaa selvittää, mitä kaksi kuukautta hyllyllä seisseessä pullossa oli.

Siksi otsikon kysymykseen on useampi kuin yksi perusteltu vastaus, ja siksi vastaus muuttui vuonna 2011.

Seoksen mukana muuttuva näkymä

Värjäystä ei keksitty kerralla. Se kehittyi vähitellen. Jokainen seoksen muutos toi näkyviin täsmälleen yhden uuden tiedon, ja näiden havaintojen järjestys on selkein tapa tarkastella historiaa.

Vuosi	Mitä astiassa oli	Mitä saattoi nähdä
1865	Pikriinihappoa, ensimmäistä vereen käytettyä synteettistä väriainetta, Wilhelm Erbin käyttämänä	Pitsimäinen kuvio joidenkin punasolujen sisällä.
1876	Metyleenisinistä, Heinrich Caron ja Adolf von Baeyerin kehittämänä BASFilla	Tuberkuloosibasilleja Robert Kochin käsissä. Verisoluja yhdessä sinisen sävyssä.
1880	Metyleenisinistä ja hapanta fuksiinia, Ehrlichin neutraali värjäys	Punasolut ja eosinofiilien jyväset punaisia, tumat tummansinisiä, lymfosyyttien solulima vaaleansinistä sekä tummanvioletteja jyväsiä, jotka ottivat vastaan molempia väriaineita. Siksi solua kutsutaan neutrofiiliksi. Ensimmäinen valkosolujen erittelylaskenta.
1888	Metyleenisinistä ja eosiinia. Czesław Chęciński	Itse loinen: sinisiä päivänkakkaramaisia muotoja (Plasmodium malariae) ja sirppimäisiä muotoja (P. falciparum -gametosyyttejä). Ei sen tumaa.
1890	Enemmän metyleenisinistä, vähemmän alkoholia sekä kaliumhydroksidia. Albert Plehn	Laajempi ja syvempi värikirjo, mukaan lukien ruusunpunaiset punasolut ja eosinofiilien jyväset. Yhä vain punaista ja sinistä.
1890	Eosiinia ja booraksilla emäksiseksi muutettua metyleenisinistä. Ernst Malachowski	Punaviolettia kromatiinia loisen sisällä, tuma erotettavissa solulimasta. Tarkoituksellisesti ja hänen kertomansa mukaan toistettavasti.
1891	Eosiinia ja metyleenisinistä yli kaksi kuukautta vanhasta homeisesta pullosta. Dmitri Romanowsky	Sama violetti kerran menetelmällä, jota muut eivät pystyneet toistamaan.
1898–1902	Kloroformilla uutettu polykrominen väriaine (Nocht); metanoli (Jenner); saostuman liuottaminen uudelleen alkoholiin (Leishman, Reuter, Wright); mitatut väriaineet ja glyseroli (Giemsa)	Violetti tarvittaessa tuotteessa, joka toimi samalla tavalla seuraavassakin laboratoriossa. Jennerin versio ilman polykromisoitua väriainetta ei tuottanut violettia.
1940–1943	Lillie, Roe ja Wilcox erottivat ainesosat ja testasivat niitä yksi kerrallaan	Azure B, ei seos, on violetin tuottava ainesosa.

Viimeisen sarakkeen kehityskulku on olennainen. Jokainen edistysaskel laajensi värikirjoa, ja jokainen laajennus toi yhden uuden rakenteen näkyviin. Violetti ei ole tekniikan koristeellinen lisä: se ratkaisee, nähdäänkö vain loisen läsnäolo vai myös se, mistä loinen koostuu. Väriaineen matka BASFin väriainetehtaalta lääketieteeseen on pidempi historia, jolla on omat lähdeasiakirjansa. Koko yllä oleva tapahtumaketju ja kunkin kohdan lähde löytyvät lähteisiin linkitetystä kehittäjien aikajanasta.

Kuva: samat kuusi seosta esitettynä sen mukaan, mitä astiassa oli ja mitä siitä saatiin. Ympyrät esittävät väriaineet, ja niiden alla olevat ruudut värit, joita kyseiset väriaineet saattoivat tuottaa verisivelyssä. Ennen vuotta 1890 yhdessäkään ei ole punaviolettia ruutua, eikä sen jälkeen yksikään jää ilman sitä.

Mies, joka käytti booraksia tarkoituksella

Ernst Malachowski oli lääkäri Breslaussa, nykyisessä Wrocławissa. Hän teki uransa yksityisvastaanotolla ja pienellä klinikalla, jota hän johti kollegansa kanssa, ja teki laboratoriotyötä omalla ajallaan. Hän syntyi Strzelnossa 12 maaliskuuta 1857, opiskeli lääketiedettä Breslaun yliopistossa ja työskenteli vuosina 1882–1887 sisätautien apulaislääkärinä Kaikkien pyhien sairaalassa, joka oli tuolloin Saksan toiseksi suurin sairaala.

Hän aloitti vuonna 1888 Chęcińskin ja Plehnin kaksoisvärjäyksellä. Vuonna 1889 tehdyssä valmisteessa hän näki malarialoisen tuman kromatiinin värjäytyvän eri tavalla kuin soluliman, mutta huomasi sitten, ettei pystynyt toistamaan tulosta. Hän kokeili metyleenisinisen happamoittamista, mikä pahensi tilannetta. Hän kokeili sen muuttamista emäksiseksi booraksilla, mikä toimi joka kerta. Hän esitteli menetelmän julkisesti 15 kesäkuuta 1890 ja julkaisi elokuussa 1891 kattavamman kuvauksen, johon sisältyi ohje booraksin käytöstä. Hän totesi värjäyksen kestävän kaksikymmentäneljä tuntia ja tulosten olevan helposti toistettavissa.

Kaksikymmentäneljä tuntia on pitkä aika diagnostisessa laboratoriossa, eikä hänen artikkelinsa käsitellyt loisen tuman violetinpunaista väriä erityisen laajasti. Olipa syy mikä tahansa, kukaan ei ryhtynyt muuttamaan metyleenisinistä tarkoituksella emäksiseksi ennen kuin Nocht teki sen uudelleen vuonna 1898. Malachowski ei enää koskaan kirjoittanut verivärjäyksestä.

Syy siihen, että hänestä tiedettiin viime aikoihin asti niin vähän, liittyy arkistoihin eikä ole erityisen arvoituksellinen. Hänen elämästään ei säilynyt juuri jälkiä lääketieteellisessä kirjallisuudessa, ja säilyneet tiedot tulivat yhtä reittiä. Hänen tyttärensä Marie lähti Saksasta Lontooseen vuonna 1939, palveli Britannian armeijassa ja asettui Kanadaan. Marien perheasiakirjojen kokoelma päätyi Leo Baeck -instituuttiin New Yorkiin. Hänen veljensä Leo kuoli ensimmäisessä maailmansodassa. Hänen sisarensa Eva karkotettiin Breslausta Izbican kauttakulkuleirille huhtikuussa 1942, eikä hän koskaan palannut. Hänen äitinsä Hedwig teki itsemurhan 22 huhtikuuta 1942 sen sijaan, että olisi jäänyt odottamaan samaa karkotusta. Malachowski oli kuollut vuonna 1934, ennen näitä tapahtumia.

Näin päättyvä sukuhistoria lakkaa myös esiintymästä lähdeviitteissä. Kaksi artikkelia, jotka palauttivat Malachowskin osaksi värjäyksen kehityshistoriaa, julkaistiin molemmat vuonna 2011. Ne koottiin Poznańin ja Wrocławin arkistoasiakirjoista sekä Marien papereista New Yorkissa.

Homeinen pullo ja onnekas venäläinen

Dmitri Romanowsky opiskeli lääketiedettä Pietarin sotilaslääketieteellisessä akatemiassa ja työskenteli malarian parissa suurimman osan urastaan. Vuonna 1890 hän julkaisi menetelmän, joka oli paperilla lähes samanlainen kuin Chęcińskin: muuntamatonta metyleenisinistä ja eosiinia, mutta hieman enemmän eosiinia.

Syyskuussa 1891 hän julkaisi menetelmän, joka teki hänet tunnetuksi, ja ratkaiseva yksityiskohta oli piilotettu ohjeisiin. Hänen parhaat tuloksensa syntyivät liuoksesta, jota hän kutsui nimellä die vorräthige Methylenlösung: metyleenisinisen varastoliuoksesta, joka oli seissyt yli kaksi kuukautta ja jonka pinnalla kasvoi hometta. Home ja seisotusaika olivat osittain demetyloineet väriainetta. Romanowsky ei tiennyt tätä eikä pystynyt hallitsemaan sitä, eivätkä muut hänen menetelmäänsä kokeilleet saaneet violettia näkyviin. Hänen väitöskirjansa oli jätetty Pietarissa kesäkuussa 1891, minkä vuoksi vakiintunut kertomus pitää vuotta 1891 löytövuotena.

Malachowskin esittely oli ollut kesäkuussa 1890, yli vuotta aiemmin, ja hänen menetelmänsä toimi tarkoituksellisesti.

Miksi menetelmä nimettiin väärän miehen mukaan

Kristine Krafts, Ernst Hempelmann ja Barbara Oleksyn kokosivat Malachowskin puolesta puhuvan aineiston, joka perustuu neljään seikkaan. Julkisen esittelyn ajankohtaan: kesäkuu 1890 verrattuna syyskuuhun 1891. Sanaan tarkoituksellinen verrattuna sanaan sattumanvarainen. Siihen, että Malachowski julkaisi menetelmänsä booraksiohjeineen, kun taas Romanowskyn menetelmä riippui hallitsemattomasta muuttujasta. Ja havaintoon, että malarialoisen tuman kuvaus ja sen paljastava violetti käytännössä katosivat kirjallisuudesta seitsemäksi vuodeksi, koska kukaan ei pystynyt toistamaan sattumalta syntynyttä versiota.

He esittävät johtopäätöksensä suorasanaisesti. Elämäkerrallisessa artikkelissa he kutsuvat kunnian kohdentamista ”irvikuvaksi” ja lainaavat Ralph Lillietä, joka kirjoitti vuonna 1978, että ”ehkä meidän pitäisi kutsua tätä värjäysperhettä Malachowskin värjäyksiksi”.

Väite on kiistanalainen, kuten etusijaa koskevat väitteet yleensä ovat, ja kiistan luonnetta kannattaa selittää sen ratkaisemisen sijaan. Etusijasta väiteltäessä on määriteltävä, mikä löytö oli. Jos löytö on violetti väri, Malachowskilla on varhaisempi dokumentoitu esittely. Jos löytö on julkaistu menetelmä, molemmat miehet julkaisivat vuonna 1891, ja nimeksi tuli Romanowsky. Jos löytö on selitys, kumpikaan ei voi vaatia kunniaa, sillä kumpikaan ei tiennyt kypsymisen olevan demetylaatiota eikä pystynyt kertomaan, miksi väri ylipäätään syntyi. Juuri tämän viimeisen kohdan yleistajuiset kertomukset sivuuttavat. Vaikuttava ainesosa oli epäpuhtaus, jota kukaan ei ollut tunnistanut, ja ensimmäinen värin tarkoituksella tuottanut henkilö teki sen toistettavalla kokeellisella reseptillä, ei ymmärtämällä, mitä resepti teki.

Vuoden 2011 kaksi artikkelia ovat kattavin julkaistu esitys Malachowskin puolesta puhuvista perusteista. Molemmat ovat vapaasti luettavissa PubMedin kautta: pitkä katsaus tunnisteella PMID 21235291 ja elämäkerrallinen artikkeli tunnisteella PMID 21660627. Katsauksen PubMed-tietueessa mainitaan myös sitä koskeva kommentti, joka julkaistiin samassa lehdessä myöhemmin samana vuonna kohdassa 86(5):366. Se muistuttaa aiheellisesti, että perusteluista kiisteltiin painetussa kirjallisuudessa heti niiden ilmestyttyä.

Kiista ei koske kemiaa. Kaikki osapuolet ovat samaa mieltä siitä, mitä violetti on ja mitkä ainesosat sen tuottavat. Erimielisyys koskee sitä, kuka pääsi siihen ensimmäisenä, ja sitä, lasketaanko sattuma, jota kukaan ei pystynyt toistamaan, ylipäätään perille pääsemiseksi.

Mitä myöhemmät nimet toivat mukanaan

Jos Malachowski tuotti violetin ensimmäisenä, miksi värjäys tunnetaan Romanowskyn, Wrightin ja Giemsan nimillä?

Koska värjäys, joka toimii kerran keksijänsä käsissä, ei ole reagenssi. Myöhempi työ teki oikukkaasta seoksesta jotakin, jota laborantti toisessa maassa saattoi käyttää tavallisena tiistaina.

Nocht pääsi tulokseen päättelemällä. Kun yksinkertainen neutraali väriaine ei antanut luotettavaa tulosta, hän päätteli violetin olevan peräisin jostakin metyleenisinisessä olevasta aineesta, joka ei ollut metyleenisinistä, ja alkoi etsiä sitä. Unna oli jo havainnut vanhentuneiden metyleenisiniliuosten värjäävän syöttösolujen jyväset punaisiksi ja ehdottanut, että väriaineen kypsyessä muodostui uusi aine. Bernthsen oli osoittanut vuonna 1885, että emäksiset olosuhteet irrottavat metyleenisinisestä metyyliryhmiä ja että nämä tuotteet ovat niitä, joita nykyään kutsumme atsuuriväriaineiksi. Nocht uutti aktiivisen fraktion kloroformilla ja saattoi kutsua sitä vain nimellä Rot aus Methylenblau, punaista metyleenisinisestä; Michaelis nimesi sen atsuuriksi I vuonna 1901. Jenner ratkaisi käytännön järjestelyt. Metyleenisinisen ja eosiinin saostuman liuottaminen uudelleen absoluuttiseen metanoliin tuotti yhden stabiilin liuoksen, joka kiinnitti sivelyn samalla kun se värjäsi sen ja poisti lämpökiinnityksen tarpeen. Leishman ja Reuter yhdistivät polykromisoidun väriaineen alkoholiliuottimeen ja saivat samalla kertaa sekä stabiiliuden että violetin. Wright korvasi kahdentoista tunnin inkuboinnin 65 °C:ssa ja kymmenen päivän seisotuksen tunnilla virtaavassa höyryssä. Giemsa luopui kokonaan satunnaisesti kypsyneen liuoksen käytöstä ja käytti mitattuja määriä tunnettuja väriaineita sekä metanoliin lisättyä glyserolia, jotta tuote kesti trooppista kuumuutta. Hän ei koskaan julkaissut puhtaan metyleeniatsuurin valmistustapaansa. Hän myi sitä tohtori Grüblerin laboratoriolle Leipzigiin, joka markkinoi sitä atsuurina I ja väitti vain oman versionsa olevan aito Giemsa-väriaine.

Tuon atsuurin identiteetistä kiistellään yhä. Joidenkin mielestä se oli yksinkertaisesti polykromisoitua metyleenisinistä, toisten mielestä se sisälsi runsaasti Azure B:tä. Vastaus löytyi sodan seurauksena. Kun saksalaisia väriaineita ei enää ollut saatavilla, Yhdysvaltain kansanterveyspalvelun ryhmä, Ralph Lillie, Maurice Roe ja Aimee Wilcox, havaitsi parhaan värjäystuloksen syntyvän kolmesta erotetusta ainesosasta: muuntamattomasta metyleenisinisestä, sen demetyloituneesta hajoamistuotteesta Azure B:stä ja eosiinista. Azure B korvasi atsuurin I, jota ei ollut saatavilla, ja nämä kolme ainesosaa ovat yhä nykyisen malarian diagnosoinnissa käytettävän värjäyksen perusta.

Näiden kolmen ainesosan vuorovaikutuksen kemia objektilasilla on erillinen kysymys ja toisen sivun aihe. Romanowsky-tyyppisten värjäysten väriaineiden roolit ja kemia käsittelee sitä, mitä Azure B ja eosiini kumpikin tekevät ja miksi ne yhdessä tuottavat värin, jota kumpikaan ei tuota yksin. Mikroskopiaa ja laboratoriosovelluksia käsittelevä sivu puolestaan kattaa käytännön puolen: mitä tietty valmiste näyttää ja miten arvioida, soveltuuko jokin tuote aiottuun menetelmään.

Historian osa, joka on yhä ajankohtainen

Yksi tämän tarinan yksityiskohta ei lakannut olemasta totta vuonna 1902. Noin viidenkymmenen vuoden ajan maailman vakiintuneen malariavärjäyksen tärkein ainesosa oli nimetön epäpuhtaus. Se oli mukana sattumalta, sen määrä vaihteli pullosta toiseen, sen identiteetti oli osan tuosta ajasta liikesalaisuus, ja sen osuudesta kiisteltiin 1940-luvulle asti. Värjäystä käyttävät ihmiset eivät olleet huolimattomia. Heillä ei ollut keinoa tietää, mitä pullossa oli.

Saman ongelman nykyversio on spesifikaatio, joka kuvaa vain osan materiaalista. USP-vaatimustenmukaisuus on tie markkinoiden korkeimpaan puhtauteen, koska se on kattava julkaistu standardi eikä yksittäinen mittaus: identiteetti, puhtaus, orgaaniset epäpuhtaudet, mukaan lukien atsuuriväriaineet, liuotinjäämät, alkuaine-epäpuhtaudet, hehkutusjäännös, mikrobiologiset raja-arvot ja bakteerien endotoksiinit. Blupreme hankkii metyleenisinisensä lääkevalmistajalta ja julkaisee koko analyysitodistuksen, jotta luettelon jokainen kohta voidaan tarkistaa pelkän vakuuttelun sijaan. Todistus, joka ilmoittaa raskasmetallimäärityksen tuloksen ja kutsuu sitä USP-vaatimustenmukaisuudeksi, on nykyajan vastine pullolle, jonka etiketissä lukee ”kypsytetty metyleenisininen”: mahdollisesti hyvä reagenssi, mutta etiketti ei kerro, mitä siinä on.