E. colin ja muiden pesäkkeiden ulkonäön tulkinta EMB-agarilla

Opiskelija hajotusviljelee tuntemattoman näytteen eosiini-metyleenisiniagarille, inkuboi sitä yön yli ja palaa maljan ääreen, jolla on tummia, vihreänä hohtavia pesäkkeitä. Muistiinpanoihin kirjataan ”E. coli, varmistettu”. Kirjaus väittää enemmän kuin maljan perusteella voidaan päätellä. Malja osoittaa kasvu- ja fermentointifenotyypin tietyissä olosuhteissa. Lajin tunnistaminen on erillinen väite, joka vaatii erillistä näyttöä.

Tässä oppaassa EMB-agarin tuloksia käsitellään tulkintatehtävänä. Opas selittää taustalla olevan periaatteen, käy läpi havainnollisen malja-atlaksen kontrolleineen ja nostaa esiin tilanteet, joissa oppikirjan mukainen ulkonäkö johtaa harhaan.

Maljan toimintaperiaate

EMB-agar on sekä selektiivinen että erotteleva kasvualusta. Eosiini Y ja metyleenisininen estävät monien grampositiivisten mikrobien kasvua, joten kasvualusta suosii gramnegatiivisten mikrobien kasvua. Samat väriaineet toimivat indikaattoreina: kun mikrobi fermentoi saatavilla olevaa sokeria ja tuottaa paikallisesti riittävästi happoa, pesäke sitoo runsaasti väriainetta ja muuttuu tummanvioletiksi tai sinimustaksi. Voimakkaan hapontuotannon yhteydessä pesäkkeen pinnalla voi näkyä metallinvihreää hohtoa. ASM:n eosiini-metyleenisinimaljojen käyttöohje kuvaa tämän selektiivisyyden ja erottelevuuden yhdistelmän ja tarjoaa vertailuvalokuvia opetuskäyttöön.

Yksi yksityiskohta on tärkeä ennen minkään tuloksen tulkintaa: tarkista käytössä oleva koostumus. Vanhempi Holt Harris Teague -koostumus sisältää laktoosia ja sakkaroosia, kun taas Levine EMB sisältää vain laktoosia. Sakkaroosia mutta ei laktoosia fermentoiva mikrobi, kuten monet Serratia marcescens -isolaatit, voi näyttää erilaiselta näillä kahdella kasvualustaversiolla. Valmistajan EMB-kasvualustojen dokumentaatio mainitsee tämän koostumuseron nimenomaisesti. Kirjaa valmistaja ja koostumus muistiinpanoihin tuloksen yhteyteen.

Valmis, siirrostamaton EMB-agar on yleensä punaruskeaa tai punertavan violettia, ja siinä voi joskus olla vihertävä sävy tai hienojakoista saostumaa. Tämä taustaväri ei ole kasvua. Vertaa jokaista tulosta siirrostamattomaan maljaan tai dokumentoituun lähtötilanteeseen. Lue alkuperäinen viljelymalja noin 18–24 tunnin aerobisen inkuboinnin jälkeen lämpötilassa 35–37 C, ellei opetuksen työohjeessa määritellä toisin. Pidempi inkubointi voi muuttaa fermentoinnin ilmenemistä.

Maljan tarkastelu

Käytä kahta valaistustapaa. Tarkastele maljaa ensin heijastuneessa tai vinosti lankeavassa valossa ja kallista sitä: metallinhohto vaihtelee katselukulman mukaan ja voi tulla näkyviin tai kadota. Tarkastele maljaa sitten läpivalossa arvioidaksesi pesäkkeiden väriä ja tummia keskustoja. Keskity hyvin erillisiin pesäkkeisiin, sillä tiheä kasvu ja viereiset pesäkkeet muuttavat paikallista hapon kertymistä ja voivat heikentää tai voimistaa väriä. ASM:n kuvasarja havainnollistaa tätä suoraan: sekaviljelmässä E. coli voi menettää odotetun hohtonsa, koska ympäröivät mikrobit muuttavat paikallisia happamuusolosuhteita.

Käytä kontrolleja aina, kun harjoitus sen sallii. Tavallinen opetuskäyttöön tarkoitettu kontrollisarja sisältää E. coli ATCC 25922 -kannan sinimustan värin ja metallinhohdon fenotyyppiä varten, fermentoimattoman mikrobin, kuten Salmonella Typhimurium ATCC 14028 tai Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, väritöntä fenotyyppiä varten sekä grampositiivisen mikrobin, kuten Enterococcus faecalis tai Staphylococcus aureus, kasvun eston kontrolliksi. Nämä on lueteltu EMB-kasvualustojen tavanomaisissa laadunvalvontataulukoissa. Jos positiivisesta kontrollista puuttuu hohto, epäile ensin inkubointia, liian tiheää kasvua tai kasvualustan koostumusta, älä tuntematonta näytettä.

Havainnollinen malja-atlas

Alla olevat maljat ovat luotuja havainnekuvia, eivät valokuvia todellisista viljelmistä. Ne esittävät tunnistettavan kuvion, eivät minkään yksittäisen kannan tarkkaa värisävyä. Vertaa niitä ASM:n vertailuvalokuviin ja opetuslaboratorion todellisiin maljoihin.

Malja 1: Escherichia coli EMB-agarilla, voimakas laktoosin fermentoija

E. coli on EMB-agarilla tyypillisesti tummanvioletti tai sinimusta. Pesäkkeissä on usein tumma keskusta ja voimakkaasta hapontuotannosta johtuva metallinvihreä hohto. Hohto on tunnettu löydös, jota opiskelijat etsivät, mutta sitä tulee pitää tulkintaa tukevana havaintona, ei määritelmänä. Hohdon voimakkuus vaihtelee kannan, inkubointiajan, pesäketiheyden ja katselukulman mukaan. Hohdon puuttuminen ei sulje pois E. colia, ja tumma pesäke ilman hohtoa voi viitata useisiin muihin fermentoiviin mikrobeihin. Valitse jatkotutkimuksiin hyvin erillinen pesäke sen sijaan, että tekisit tulkinnan tiheäkasvuiselta alueelta.

Malja 2: Klebsiella pneumoniae EMB-agarilla, limainen fermentoiva mikrobi

Klebsiella pneumoniae muodostaa EMB-agarilla tyypillisesti suuria, kiiltäviä ja limaisia pesäkkeitä, joiden sävy vaihtelee vaaleanpunaisen violetista ruskeanviolettiin. Pesäkkeissä on usein tummat keskustat, mutta yleensä ei voimakasta metallinhohtoa. Samankaltaista morfologiaa esiintyy sukulaismikrobeilla, jotka fermentoivat sokereita, kuten Enterobacterilla. Limaisuus ja pesäkkeen koko ovat osa tulkintaa: pieni ja litteä vaaleanpunainen pesäke saa tulkinnassa eri painoarvon kuin suuri, kupera ja limainen pesäke. Kuten E. colin kohdalla, malja antaa viitteitä fermentointifenotyypistä, ja lajitasoinen nimeäminen vaatii jäljempänä kuvattua biokemiallista varmistusta.

Malja 3: Salmonella EMB-agarilla ja muut fermentoimattomat mikrobit, värittömät pesäkkeet

Salmonella ja muut laktoosia fermentoimattomat mikrobit, kuten Shigella ja monet Pseudomonas-isolaatit, kasvavat EMB-agarilla tyypillisesti värittöminä, läpikuultavina tai vaalean meripihkanvärisinä pesäkkeinä. Jotkin koostumukset ja olosuhteet tuottavat heikon punertavan sävyn, joten vaaleanpunainen pesäke ei automaattisesti tarkoita fermentoivaa mikrobia. EMB ei erota Salmonellaa Shigellasta eikä muista fermentoimattomista mikrobeista; erottelu kuuluu myöhempiin testeihin. Lisäksi on dokumentoitu laktoosipositiivisia Salmonella-kantoja, joiden metallinhohtoiset pesäkkeet muistuttavat E. colia. Tämä on jälleen yksi syy siihen, ettei yksi malja riitä lopulliseen tunnistukseen.

Malja 4: Serratia marcescens ja koostumuksen sudenkuoppa

Serratia marcescens ansaitsee oman osionsa, koska opiskelijat odottavat usein punaisia pesäkkeitä ja tulkitsevat siksi maljan väärin. Useimmat kliiniset isolaatit eivät fermentoi laktoosia, joten Levine EMB -agarilla ne näyttävät tavallisesti vaaleilta tai heikosti värjäytyneiltä. Koska monet isolaatit fermentoivat sakkaroosia, sitä sisältävä koostumus voi tuottaa tummemman tai voimakkaammin happamuuteen liittyvän reaktion. Älä myöskään odota tyypillistä punaista prodigiosiinipigmenttiä lämpötilassa 35–37 C; pigmentin muodostuminen on epävarmaa inkubaattorin lämpötilassa. Kun työohjeessa mainitaan Serratia marcescens EMB-agarilla, tarkista, mitä koostumusta kuvaus koskee. Serratian aineenvaihduntaa käsittelevä katsaus tiivistää tämän sudenkuopan taustalla olevan laktoosinegatiivisuuden ja sakkaroosin fermentoinnin vaihtelun.

Malja 5: kontrollit ja mikrobit, joiden kasvu estyy

Grampositiivisten mikrobien, kuten Staphylococcus-, Enterococcus-, Streptococcus- ja Bacillus-sukujen, kasvu yleensä estyy tai heikkenee huomattavasti EMB-agarilla, vaikka esto ei ole täydellinen kaikilla kannoilla. Kontrollisarja auttaa pitämään tulkinnan luotettavana: E. coli -kontrollissa pitäisi näkyä hyvää kasvua, sinimusta väri ja hohto, fermentoimattoman mikrobin kontrollissa väritöntä kasvua ja kasvun eston kontrollissa vain vähän kasvua tai ei kasvua lainkaan. Jos kasvun eston kontrolli kasvaa hyvin, selektiivisyys ei ole toiminut ja kaikki muut kyseisen erän tulkinnat ovat epävarmoja. Värjäysmenetelmät vastaavat eri kysymykseen kuin viljelyalustat. Laboratorion objektilasivärjäyksiä käsittelee metyleenisinivärjäyksen atlas.

Vertailu ja sen rajat

Kolme lausetta tiivistää harhaanjohtavat ulkonäöt. Tumma ei tarkoita E. colia, sillä Klebsiella, Enterobacter ja muut fermentoivat mikrobit muodostavat tummia keskustoja ilman hohtoa. Vaaleanpunainen ei tarkoita Klebsiellaa, sillä kohtalaisesti tai hitaasti fermentoivat mikrobit ja jotkin tavallisesti fermentoimattomiksi luokitellut mikrobit näyttävät vaaleanpunaisilta tai vaaleanvioleteilta. Hohto ei tarkoita varmistettua E. colia, sillä myös muut voimakkaasti fermentoivat mikrobit voivat tuottaa sitä. Opetuksen työohje ja sen sekaviljelmäkuvat havainnollistavat näitä kaikkia tulkinnan sudenkuoppia.

Varmistamisen rajat

EMB-agar osoittaa fenotyypin, ei lajia. Eri mikrobien pesäkkeet voivat näyttää samanlaisilta, ja saman mikrobin ulkonäkö voi poiketa oppikirjan kuvauksesta kannan, iän, kasvutiheyden, koostumuksen ja inkuboinnin mukaan. Siksi opetuksen ja kliinisten laboratorioiden työnkuluissa EMB-morfologiaa pidetään alustavana viitteenä.

Opiskelijalle perusteltu työnkulku on seuraava: kuvaile erillinen pesäke (koko, väri, keskusta, hohto vinossa valossa ja limaisuus), kirjaa koostumus, inkubointiaika ja -lämpötila sekä kontrollit ja tee sitten hyvin erillisestä pesäkkeestä puhdasviljelmä ennen varmistustestejä. Tavallisia jatkotutkimuksia ovat gramvärjäys ja IMViC-reaktiot E. colin ja koliformien alustavaa tunnistusta varten sekä TSI tai KIA ja mikrobikohtaiset biokemialliset testipaneelit suolistobakteereille. Tarvittaessa käytetään serologista tunnistusta, MALDI TOF -menetelmää tai muuta validoitua tunnistusmenetelmää. Taustatietoa EMB:n asemasta selektiivisten ja erottelevien suolistobakteerien kasvualustojen joukossa löytyy suolistobakteerien viljelyalustojen johdannoista ja gramvärjäystä käsittelevästä jatkoartikkelista. Siihen liittyvää kysymystä siitä, mitä sininen objektilasivärjäys voi ja ei voi osoittaa, käsittelee metyleenisinivärjäyksen atlas, jossa havainto ja johtopäätös pidetään samalla tavoin erillään.

Kirjaa havainto ennen johtopäätöstä. ”Tummia sinimustia pesäkkeitä, joissa on katselukulmasta riippuva vihreä hohto Levine EMB -agarilla 24 tunnin kohdalla; sopii voimakkaaseen laktoosin fermentointiin” on perusteltu kirjaus. ”E. coli, varmistettu” edellyttää varmistusvaihetta, jota pelkkä malja ei voi korvata.