اندازه‌گیری اثرات میتوکندریایی متیلن بلو: اکسیژن، ATP و پتانسیل غشا

فرض کنید آزمایشگاهی متیلن بلو را به میتوکندری‌هایی با اختلال تنفسی اضافه می‌کند و افزایش مصرف اکسیژن را مشاهده می‌کند. جمله‌ای که به‌طور طبیعی به ذهن می‌رسد این است که رنگ، عملکرد میتوکندری را بازیابی کرده است. این جمله ممکن است نادرست باشد. شار اکسیژن، سنتز ATP و پتانسیل غشا سه مفهوم مجزا هستند. هر سه به یک اندامک مربوط‌اند، همان‌طور که پشتیبان‌گیری، همگام‌سازی و اشتراک‌گذاری به یک پوشهٔ ابری مربوط می‌شوند: با هم ارتباط دارند، اما از قواعد متفاوتی پیروی می‌کنند. اگر یکی را با دیگری اشتباه بگیرید، تفسیر به خطا می‌رود، حتی وقتی تمام اندازه‌گیری‌ها از نظر فنی درست باشند.

متیلن بلو احتمال این اشتباه را بالا می‌برد، چون در سامانه‌ای که اندازه‌گیری می‌شود مشارکت دارد. این ماده در چرخهٔ اکسایش‌کاهش شرکت می‌کند، الکترون‌ها را در بالادست می‌پذیرد و در پایین‌دست واگذار می‌کند؛ کاتیونی چربی‌دوست است که در میتوکندری‌های دارای انرژی انباشته می‌شود؛ و ترکیبی به‌شدت آبی‌رنگ است که در همان نوارهای طیفی پروب‌های رایج، نور را جذب و گسیل می‌کند. یک خروجی اندازه‌گیری به‌تنهایی نمی‌تواند همهٔ این پیچیدگی‌ها را پوشش دهد. الگوی قابل‌اعتماد، که در مجموعهٔ مطالعات میتوکندریایی بوداپست نشان داده شده، اندازه‌گیری هم‌زمان شار اکسیژن، نرخ سنتز ATP، پتانسیل غشا و آزادسازی پراکسید هیدروژن است، همراه با کنترل‌های اختصاصی رنگ در هر مرحله.

تنفس‌سنجی شار اکسیژن را اندازه می‌گیرد، نه برون‌ده انرژی را

تنفس‌سنجی با تفکیک‌پذیری بالا، چه با Oroboros Oxygraph و چه با تحلیلگر شار خارج‌سلولی Seahorse، یک چیز را گزارش می‌کند: اکسیژن با چه سرعتی احیا می‌شود. این سنجش نشان نمی‌دهد به‌ازای هر الکترون چند پروتون پمپ شده، چه مقدار از شیب حفظ شده، یا آیا ATP سنتاز از آن استفاده کرده است.

واژگان اهمیت دارند. در میتوکندری‌های جداشده، سوبسترا بدون ADP تنفس نشتی را نشان می‌دهد، سوبسترا همراه با ADP در حد اشباع ظرفیت فسفریلاسیون اکسیداتیو را نشان می‌دهد و تیتراسیون عامل جداکنندهٔ جفت‌شدگی، حداکثر ظرفیت انتقال الکترون را مشخص می‌کند. در سلول‌های دست‌نخورده، معادل‌های Seahorse عبارت‌اند از تنفس پایه، تنفس وابسته به ATP و حساس به الیگومایسین، نشت پروتون، حداکثر تنفس تعیین‌شده با FCCP و مصرف اکسیژن غیرمیتوکندریایی مقاوم به روتنون و آنتی‌مایسین. نامیدن خروجی‌های Seahorse به‌عنوان حالت 3 و حالت 4، دقتی را القا می‌کند که این نوع نمونه از آن پشتیبانی نمی‌کند؛ موضوعی که چارچوب آزمون استرس میتوکندری Agilent روشن می‌سازد.

متیلن بلو پیوند شهودی میان اکسیژن بیشتر و انرژی بیشتر را بر هم می‌زند. طبق مطالعهٔ میتوکندری‌های جداشدهٔ مغز، در میتوکندری‌های جداشدهٔ مغز خوکچهٔ هندی، رنگ با غلظت 100 nM تا 1 uM مصرف اکسیژن در حالت استراحت را با سوبستراهای گلوتامات همراه با مالات، سوکسینات و آلفا-گلیسروفسفات افزایش داد؛ افزایش با آلفا-گلیسروفسفات حدود 64 درصد بود، اما تنفس تحریک‌شده با ADP در میتوکندری‌های سالم عملاً تغییری نکرد. چون تنفس نشتی افزایش یافت ولی شار تحریک‌شده با ADP ثابت ماند، نسبت محاسبه‌شدهٔ کنترل تنفسی کاهش می‌یابد. این کاهش به معنای آسیب‌دیدن میتوکندری‌ها بر اثر رنگ نیست. بلکه یعنی رنگ، یک چرخهٔ اکسایش‌کاهش مصرف‌کنندهٔ اکسیژن را به تنفس طبیعی افزوده است. سنجش مصرف اکسیژن متیلن بلو که فقط این افزایش را گزارش می‌کند، شیمی واقعی را اندازه گرفته، اما چیزی دربارهٔ حفظ انرژی نگفته است.

آزمایش‌های بازیابی همین فاصله را در مقیاسی بزرگ‌تر نشان می‌دهند. با مسدودشدن کمپلکس I، شار اکسیژن حدود سه‌برابر افزایش یافت، در حالی که سنتز ATP فقط حدود 1.5 برابر افزایش یافت. اکسیژن بیشتری به الکترود رسید، اما سهم کمتری از آن صرف تولید ATP شد. هر ادعایی دربارهٔ بهبود فسفریلاسیون اکسیداتیو به داده‌های ATP نیز نیاز دارد؛ بهتر است این داده‌ها به‌صورت نسبت ATP به اکسیژن بیان شوند و قرارداد به‌کاررفته برای مخرج نیز مشخص باشد.

سنجش‌های ATP نرخ سنتز را اندازه می‌گیرند؛ مقدار ATP جایگزین آن نیست

سنجش ATP به پرسش متفاوتی پاسخ می‌دهد: در واحد زمان چه مقدار ATP تولید می‌شود. یک خروجی سینتیکی، چه لومینسانس لوسیفراز کرم شب‌تاب که طی چند دقیقه دنبال می‌شود و چه سنجش جفت‌شدهٔ هگزوکیناز و گلوکز-6-فسفات دهیدروژناز با قرائت در 340 nm، یک نرخ به دست می‌دهد. اندازه‌گیری ATP کل در یک نقطهٔ پایانی، مقدار ATP را نشان می‌دهد؛ مقداری که بازتاب سنتز منهای مصرف است و به‌تنهایی اطلاعات چندانی دربارهٔ فسفریلاسیون اکسیداتیو نمی‌دهد.

گروه بوداپست از روش آنزیمی جفت‌شده، همراه با مهار آدنیلات کیناز، استفاده کرد و دریافت که متیلن بلو در غلظت 1 تا 2 uM تولید ATP را در میتوکندری‌های تیمارشده با روتنون و آنتی‌مایسین به میزان اندک اما معنی‌داری افزایش می‌دهد. این بازیابی واقعی است، اما جزئی است. مطالعهٔ سمیت TEGDMA در مدلی متفاوت به نتیجه‌ای با همین الگو رسید: مونومر دندان‌پزشکی TEGDMA با غلظت 5 mM، تنفس وابسته به کمپلکس I را از حدود 286 به 28 واحد شار کاهش داد و رنگ با غلظت 2 uM آن را به حدود 86 رساند.

برای یک ترکیب رنگی فعال در اکسایش‌کاهش، دو کنترل ضروری‌اند. نخست، آزمایش را با الیگومایسین انجام دهید تا مشخص شود چه مقدار از سنتز ATP اندازه‌گیری‌شده به ATP سنتاز وابسته است. دوم، در سامانه‌ای بدون سلول، آزمون بازیابی پس از افزودن مقدار معلوم ATP را با مجموعهٔ کامل معرف‌ها و دقیقاً همان غلظت‌های رنگ مورد استفاده انجام دهید؛ دست‌کم 0، 100 nM، 300 nM، 1 uM و 2 uM. رنگ می‌تواند نور گسیل‌شده را جذب کند، آنزیم گزارشگر را مهار کند یا شیمی اکسایش‌کاهش معرف را تغییر دهد؛ راهنمای عمومی سنجش لوسیفراز نیز دقیقاً برای همین نوع تداخل، آزمون‌های بیوشیمیایی مقابله‌ای را توصیه می‌کند. فرض نکنید که 1 uM عاری از آرتیفکت است، فقط به این دلیل که خاموشی معمولاً در غلظت‌های بالاتر شدیدتر است.

پروب‌های پتانسیل غشا توزیع رنگ را اندازه می‌گیرند، نه شار را

سافرانین O، TMRM و TMRE، رودامین 123 و JC-1 همگی کاتیون‌های نفوذپذیر از غشا هستند. آن‌ها طبق تعادل الکتروشیمیایی در ماتریکس با بار منفی انباشته می‌شوند؛ بنابراین فلورسانس کلی، پتانسیل را به‌طور غیرمستقیم و از طریق محل استقرار پروب گزارش می‌کند. هیچ‌کدام ATP یا شار الکترون را اندازه نمی‌گیرند.

هر پروب برای نوع خاصی از نمونه مناسب‌تر است. سافرانین O برای میتوکندری‌های جداشده و سلول‌های نفوذپذیرشده مناسب است؛ معمولاً با غلظتی نزدیک به 2 uM، تحریک نزدیک به 495 nm و گسیل نزدیک به 585 nm، در حالت خاموشی کار می‌کند که در آن جذب پروب، فلورسانس کلی را تغییر می‌دهد. TMRM و TMRE برای سلول‌های دست‌نخورده با بارگذاری در غلظت‌های پایین نانومولار و در حالت بدون خاموشی مناسب‌اند؛ در این حالت، دپلاریزاسیون رنگ را آزاد می‌کند و فلورسانس میتوکندریایی کاهش می‌یابد. در بارگذاری بالا، جهت سیگنال ممکن است بر اثر خودخاموشی معکوس شود. JC-1 نسبت سبز به قرمز مناسبی ارائه می‌دهد، اما به بارگذاری و جرم میتوکندریایی وابسته است؛ به همین دلیل، برای کار کمی نسبت به TMRM با کنترل دقیق، گزینهٔ ضعیف‌تری است. این موازنه‌ها در یک مرور پرکاربرد دربارهٔ پروب‌های پتانسیل غشای میتوکندری خلاصه شده‌اند.

متیلن بلو دقیقاً در غلظت‌های کاری تداخل نوری ایجاد می‌کند. نوارهای جذب آن نزدیک به 600 تا 665 nm با گسیل قرمز پروب‌ها هم‌پوشانی دارند؛ بنابراین اثرات فیلتر داخلی، خاموشی و جذب نور تحریک همگی محتمل‌اند. این رنگ همچنین یک کاتیون چربی‌دوست دوم است که توزیع خودش با پتانسیل در حال اندازه‌گیری تغییر می‌کند. راه مقابله، استفاده از اندازه‌گیری‌های مستقل و بلانک‌هاست: پروب به‌تنهایی، رنگ به‌تنهایی، پروب همراه با هر غلظت رنگ، دپلاریزاسیون کامل با FCCP به‌عنوان مرجع صفر و، در حالت ایده‌آل، پروب دومی با ویژگی‌های نوری متفاوت. مطالعهٔ دورزدن کمپلکس III این رویکرد را به کار گرفت: بازیابی پتانسیل غشا پس از مهار با آنتی‌مایسین و میکسوتیازول، هم با سافرانین O و هم با TMRM تکرار شد و هر دو بازیابی کیفی یکسانی نشان دادند. یک گزارشگر نوری، سرنخ است. دو گزارشگر مستقل، شاهد هستند.

سه نوع نمونه، سه پرسش متفاوت

میتوکندری‌های جداشده، سلول‌های نفوذپذیرشده و سلول‌های دست‌نخورده، تنظیمات قابل‌تعویض حساسیت در یک سنجش واحد نیستند. آن‌ها مفاهیم متفاوتی با اصول عملیاتی متفاوت‌اند.

میتوکندری‌های جداشده زنجیرهٔ انتقال الکترون، غشای داخلی و دستگاه مولکولی ماتریکس را حفظ می‌کنند، اما غشای پلاسمایی، سیتوزول و معماری شبکه را حذف می‌کنند. هدف دقیقاً همین حذف است: سوبستراها، ADP، مهارکننده‌ها و غلظت‌های رنگ به‌دقت تعریف می‌شوند تا بتوان مسیر را مشخص کرد. بهای آن، از دست رفتن تأمین طبیعی سوبسترا، پیام‌رسانی و تقاضای انرژی است.

سلول‌های نفوذپذیرشده، میتوکندری‌ها را در بخش بزرگی از معماری سلولی خود نگه می‌دارند، در حالی که به سوبستراهای خارجی و ADP اجازه می‌دهند از غشای پلاسمایی بازشده عبور کنند. آن‌ها ابزار مناسبی برای تعیین نقص یک مسیر وابسته به سوبسترا در بستر سلولی هستند. نفوذپذیرسازی بیش‌ازحد به غشای خارجی آسیب می‌زند و تنظیم سیتوزولی در اثر شست‌وشو از بین می‌رود.

سلول‌های دست‌نخورده همه‌چیز را حفظ می‌کنند: سد غشای پلاسمایی، عوامل احیاکنندهٔ سیتوزولی، انتقال سوبستراهای درون‌زاد، شبکهٔ میتوکندریایی و تقاضای ATP. آن‌ها به فیزیولوژی نزدیک‌تر و از سازوکار دورترند، زیرا جذب، احیا و محبوس‌شدن رنگ، همگی میزان مواجههٔ مؤثر میتوکندری با آن را تعیین می‌کنند.

مطالعهٔ TEGDMA آگاهانه از هر سه سطح استفاده کرد: میتوکندری‌های جداشدهٔ مغز برای بررسی بازیابی اکسیداسیون و پتانسیل با رنگ؛ سلول‌های بنیادی نفوذپذیرشدهٔ پالپ دندان عمدتاً برای تعیین محل اختلال در اکسیداسیون سوبستراهای وابسته به کمپلکس I؛ و سلول‌های بنیادی دست‌نخورده برای بررسی اثر خالص فیزیولوژیک رنگ با غلظت 2 uM بر مصرف اکسیژن سرکوب‌شده. برای خوانندگانی که خروجی‌های میتوکندریایی را میان انواع نمونه مقایسه می‌کنند، مقالهٔ توضیحی همراه دربارهٔ چگونگی انتقال الکترون‌ها توسط متیلن بلو در زنجیرهٔ تنفسی، پیش‌زمینهٔ مسیر را ارائه می‌کند و راهنمای خواندن مطالعات تنفسی متیلن بلو، منطق غلظت و مهارکننده‌ها را پوشش می‌دهد.

کنترل‌های موردنیاز برای یک رنگ فعال در اکسایش‌کاهش

ماده‌ای که در چرخهٔ اکسایش‌کاهش شرکت می‌کند، به فهرست کنترل طولانی‌تری نسبت به یک مهارکنندهٔ معمولی نیاز دارد، چون واکنش‌های شیمیایی خود رنگ می‌توانند رفتار زیستی را تقلید کنند.

برای تنفس‌سنجی، از محفظه‌ای حاوی فقط بافر برای بررسی رانش، محفظه‌ای حاوی بافر و رنگ بدون مادهٔ زیستی، رنگ همراه با هر عامل احیاکنندهٔ خارج‌سلولی موجود در سنجش و افزودن نهایی روتنون و آنتی‌مایسین برای تعیین مصرف اکسیژن غیرمیتوکندریایی در سلول‌های دست‌نخورده استفاده کنید. توجه کنید که رنگ احیاشده با انتقال الکترون‌ها به اکسیژن و تشکیل پراکسید هیدروژن دوباره اکسید می‌شود؛ بنابراین بلانک حاوی فقط رنگ، بدون دهندهٔ الکترون، مصرف اکسیژن بدون سلولی را که با در دسترس قرارگرفتن NADH یا NADPH رخ می‌دهد، کمتر از مقدار واقعی برآورد می‌کند.

برای پراکسید هیدروژن، Amplex UltraRed کالیبره‌شده همراه با پراکسیداز ترب کوهی را به رنگ‌های غیرانتخابی DCFDA ترجیح دهید، نتیجه را با کاتالاز تأیید کنید و وابستگی به تابش نور را بیازمایید، زیرا رنگ یک حساس‌کنندهٔ نوری است. مطالعهٔ میتوکندری‌های مغز نشان داد که فقط در غلظت 100 nM رنگ، بار پراکسید بیش از چهاربرابر افزایش یافت و هم‌زمان حذف آن کند شد؛ پراکسید مستقیماً توسط رنگ احیاشده و بدون واسطهٔ سوپراکسید تشکیل می‌شد. جزئیات انتخاب پروب و کنترل‌های نور در مقالهٔ همراه دربارهٔ اندازه‌گیری گونه‌های فعال اکسیژن در آزمایش‌های رنگ آمده است و پرسش گسترده‌تر دربارهٔ اینکه پراکسید چه زمانی نقش پیام‌رسان و چه زمانی نقش بار اضافی دارد، در کنار موضوع تعادل اکسایش‌کاهش سلولی و ادعاهای آنتی‌اکسیدانی بررسی شده است.

برای ادعاهای مربوط به مسیر، هر دو جایگاه مهار کمپلکس III را بیازمایید: آنتی‌مایسین A در جایگاه Qi و میکسوتیازول در جایگاه Qo؛ همچنین از سیانید برای آزمون نهایی کمپلکس IV استفاده کنید. یک مطالعهٔ قدیمی‌تر روی مغز موش، بازیابی تنفس مسدودشده با روتنون را توسط رنگ گزارش کرد، اما این بازیابی را برای تنفس مسدودشده با آنتی‌مایسین مشاهده نکرد. در مقابل، مطالعهٔ بعدی روی سه گونه، بازیابی جزئی با هر دو مهارکننده و شواهدی از احیای مستقیم سیتوکروم c یافت. دورزدن مسیر را با داده‌های جدیدتر سازگار بدانید، نه قطعی و تثبیت‌شده؛ زیرا غلظت رنگ، جایگاه مهارکننده، وضعیت سوبسترا و توزیع رنگ، همگی مسیر مشاهده‌شده را تغییر می‌دهند.

ماتریس انتخاب سنجش

از این جدول استفاده کنید تا اندازه‌گیری را بر اساس پرسش انتخاب کنید، نه برعکس.

حداقل مجموعهٔ لازم برای یک ادعای متقاعدکننده، بررسی غلظت‌های یکسان رنگ، یعنی 100 nM، 300 nM، 1 uM و 2 uM، در این اندازه‌گیری‌هاست: شار اکسیژن در شرایط نشتی، ADP، الیگومایسین و عامل جداکنندهٔ جفت‌شدگی؛ نرخ سنتز ATP؛ پتانسیل غشا ترجیحاً با دو پروب؛ و آزادسازی کالیبره‌شدهٔ پراکسید همراه با کاتالاز و کنترل‌های بدون سلول. مجموعهٔ به‌هم‌پیوسته را گزارش کنید: شار اکسیژن، نرخ ATP، ATP به‌ازای اکسیژن، پتانسیل و پراکسید. هرکدام از این اعداد به‌تنهایی، اندازه‌گیری‌ای است که هنوز به دنبال معنا می‌گردد.