مقاله
چرا متیلن بلو به‌عنوان رنگ متقابل در رنگ‌آمیزی اسیدفست استفاده می‌شود
تکنسینی پس از تکمیل مراحل رنگ‌آمیزی، اسمیر خلط را بررسی می‌کند. باکتری‌های میله‌ای قرمز در برابر زمینه‌ای آبی برجسته‌اند و گزارش با عبارت «باسیل‌های اسیدفست مشاهده شد» صادر می‌شود. روز بعد، لام دیگری زمینه‌ای یکدست آبی و بدون باکتری‌های میله‌ای قرمز نشان می‌دهد و نتیجه آن «منفی از نظر سل» گزارش می‌شود. یکی از این گزارش‌ها ادعایی فراتر از شواهد لام دارد، و آن گزارش اول نیست.
این سردرگمی مفهومی است. تکنسین رنگ آبی را بخشی از فرایند شیمیایی شناسایی تلقی کرده، گویی متیلن بلو به یافتن مایکوباکتری‌ها کمک کرده است. چنین نیست. وقتی متیلن بلو با لام تماس پیدا می‌کند، آزمون از پیش انجام شده است. این رنگ فقط زمینه را رنگ می‌کند تا نتیجه قابل خواندن باشد. این مقاله هدف استفاده از متیلن بلو در رنگ‌آمیزی اسیدفست، دلیل انتخاب رنگ آبی به‌جای رنگ‌های دیگر، و حدود نتیجه‌گیری مجاز از تقابل قرمز و آبی را توضیح می‌دهد.
پاسخ کوتاه
رنگ‌آمیزی اسیدفست یک آزمون افتراقی بر پایه سه اصل است. کربول فوشین، رنگ اولیه، با روش‌هایی به درون همه سلول‌ها، از جمله مایکوباکتری‌های دارای پوشش مومی، وارد می‌شود. اسید-الکل، عامل رنگ‌بر، رنگ قرمز را از سلول‌های معمولی خارج می‌کند، اما نمی‌تواند آن را از سلول‌های اسیدفست بیرون بکشد. سپس متیلن بلو، رنگ متقابل، تمام اجزایی را که عامل رنگ‌بر بی‌رنگ کرده است رنگ می‌کند؛ در نتیجه سلول‌های غیراسیدفست، سلول‌های میزبان و بقایا آبی دیده می‌شوند، در حالی که باسیل‌های اسیدفست قرمز می‌مانند. رنگ متقابل کنتراست ایجاد می‌کند. این رنگ هیچ نقشی در فرایند شیمیایی‌ای که یک سلول را اسیدفست می‌کند ندارد.
هر مرحله چه کاری انجام می‌دهد
نمودار زیر تقسیم وظایف را نشان می‌دهد. مراحل کار را از چپ به راست بخوانید و نوار پایین را یادآوری این نکته بدانید که هر گروه از روش‌های رنگ‌آمیزی به پرسش متفاوتی پاسخ می‌دهد.
نخست، نفوذ رنگ انجام می‌شود. مایکوباکتری‌ها در برابر رنگ‌های آبی معمولی مقاومت می‌کنند، زیرا پوشش آن‌ها به‌طور غیرمعمولی آب‌گریز است؛ بنابراین پروتکل، ورود رنگ را تسهیل می‌کند. در روش زیل-نلسن، حرارت تا حد بخار کردن، کربول فوشین حاوی فنول را از دیواره مومی عبور می‌دهد. در روش سرد کینیون، فرمولاسیونی بسیار غلیظ‌تر از رنگ اولیه جایگزین حرارت می‌شود و در برخی نسخه‌های اصلاح‌شده بدون حرارت، مواد فعال سطحی نیز افزوده می‌شوند. پروتکل‌های رنگ‌آمیزی اسیدفست انجمن میکروبیولوژی آمریکا هر دو فرمولاسیون را در کنار هم مستند کرده‌اند و تفاوت غلظت چشمگیر است: تقریباً 0.3 g فوشین بازی در هر 100 mL برای روش گرم، در برابر حدود 4 g برای روش سرد.
در مرحله دوم، افتراق انجام می‌شود. اسید-الکل، که معمولاً از 3 mL اسید هیدروکلریک غلیظ در 97 mL اتانول 95 درصد تشکیل می‌شود، رنگ قرمز را از هر سلولی که دیواره‌اش مقاومت ویژه‌ای ندارد می‌شوید. سلول‌هایی با پوشش لیپیدی سالم مایکوباکتریایی، رنگ را نگه می‌دارند. کل روش بر این مرحله استوار است و همان‌طور که در ادامه توضیح داده می‌شود، این مرحله بیش از همه به نحوه اجرا حساس است.
کنتراست در پایان ایجاد می‌شود. اکنون لام حاوی سلول‌های اسیدفست قرمز روی زمینه‌ای تقریباً بی‌رنگ از سلول‌های رنگ‌زدایی‌شده است. متیلن بلو با غلظت 0.3 درصد w/v این زمینه را با رنگی که بیشترین تمایز را از قرمز دارد، دوباره قابل مشاهده می‌کند. رنگ‌آمیزی متقابل کوتاه است؛ معمولاً در روش گرم 20 تا 30 ثانیه و در برخی گونه‌های روش سرد تا چند دقیقه طول می‌کشد. زمان‌بندی به پروتکل بستگی دارد، نه به ویژگی ذاتی خود رنگ.
چرا این رنگ، و چرا آبی
متیلن بلو یک رنگ بازی کاتیونی است؛ یعنی یون رنگی آن بار مثبت دارد و به سطوح دارای بار منفی باکتری‌های رنگ‌زدایی‌شده، سلول‌های میزبان و بقایا متصل می‌شود. میکروبیولوژی OpenStax این منطق بار الکتریکی را اصل عمومی عملکرد رنگ‌های بازی توصیف می‌کند. اما متیلن بلو در این کاربرد از نظر شیمیایی منحصربه‌فرد نیست. کریستال ویوله و سافرانین نیز رنگ‌های بازی هستند. مبنای انتخاب، نوری است نه شیمیایی.
باکتری‌های میله‌ای قرمز به زمینه‌ای با رنگ متضاد نیاز دارند و آبی، در میکروسکوپی میدان روشن، مفیدترین تقابل را با قرمز ایجاد می‌کند. سافرانین رنگ متقابل مناسبی نیست، زیرا رنگ نهایی صورتی-قرمز آن بیش از حد به کربول فوشین باقی‌مانده نزدیک است و همان تمایزی را از بین می‌برد که این روش ایجاد کرده است. کریستال ویوله زمینه‌ای بنفش تیره ایجاد می‌کند که برای جلب توجه با باسیل‌های باریک قرمز رقابت می‌کند. قوی‌ترین شاهد اینکه وظیفه این مرحله ایجاد کنتراست است، نه انجام واکنش شیمیایی، امکان جایگزینی رنگ است: رنگ‌های متقابل سبز مانند مالاشیت گرین و بریلیانت گرین در برخی پروتکل‌های دامپزشکی و اصلاح‌شده به کار می‌روند و آزمون همچنان کار می‌کند، زیرا هر رنگی که به‌وضوح متفاوت باشد همان وظیفه را انجام می‌دهد.
از این موضوع دو نتیجه عملی به دست می‌آید. نخست، دستور تهیه استاندارد هیچ تنظیمی برای pH مشخص نمی‌کند؛ این محلول آبی ساده 0.3 درصد را با فرمولاسیون‌های قلیایی مانند متیلن بلو لوفلر اشتباه نگیرید؛ آن‌ها به مفهوم متفاوتی از رنگ‌آمیزی تعلق دارند. دوم، زیاده‌روی زیان‌بار است. منابع بافت‌شناسی به‌طور مشخص هشدار می‌دهند که زمینه آبی بیش از حد پررنگ می‌تواند باسیل‌های کم‌شمار را پنهان کند؛ بنابراین نگه داشتن رنگ روی لام برای مدتی طولانی‌تر از حد مجاز پروتکل، بدون هیچ فایده‌ای از خوانایی می‌کاهد.
شیمی دیواره‌ای که این آزمون را ممکن می‌کند
دلیل توانایی اسید-الکل در افتراق، در پوشش مایکوباکتریایی نهفته است. هسته ساختاری آن مجموعه میکولیل-آرابینوگالاکتان-پپتیدوگلیکان است: پپتیدوگلیکان به آرابینوگالاکتان متصل است و انتهای بیرونی آرابینوگالاکتان حامل اسیدهای میکولیک با زنجیره‌های بسیار بلند است؛ این ساختار، میکوممبران بیرونی غنی از لیپید با نفوذپذیری به‌طور غیرمعمول پایین ایجاد می‌کند. مقاله مروری درباره غشای بیرونی مایکوباکتری‌ها این معماری را به‌تفصیل شرح می‌دهد. این سد در هر دو جهت عمل می‌کند. در برابر ورود رنگ مقاومت می‌کند؛ به همین دلیل نفوذ به حرارت یا رنگ اولیه قوی‌تر نیاز دارد. همچنین در برابر خروج رنگ مقاومت می‌کند؛ به همین دلیل اسید-الکل پس از ورود کربول فوشین به داخل سلول، نمی‌تواند آن را خارج کند. باکتری‌های معمولی فاقد این پوشش‌اند و رنگ را از دست می‌دهند. بنابراین اسیدفست بودن را بهتر است پدیده‌ای ناشی از سد لیپیدی بدانیم، نه اتصال شیمیایی فوشین به اسید میکولیک.
این ویژگی شیمیایی یک معمای رایج را نیز توضیح می‌دهد: مایکوباکتری‌ها با روش گرم به‌خوبی و به‌طور قابل پیش‌بینی رنگ نمی‌گیرند و گاهی به‌صورت اشکال کم‌رنگ دانه‌دانه یا شبح‌های بی‌رنگ ظاهر می‌شوند. دیواره آب‌گریز آن‌ها نفوذ کریستال ویوله را محدود می‌کند. رنگ‌آمیزی اسیدفست، شکل اصلاح‌شده رنگ‌آمیزی گرم نیست. این روش بر اصل افتراقی متفاوتی استوار است که ویژگی دیگری از دیواره را مبنا قرار می‌دهد؛ همان‌طور که مقایسه رنگ‌آمیزی ساده و رنگ‌آمیزی گرم درباره دو روش دیگر نشان می‌دهد.
سه روش، سه پرسش
| روش | آزمون انجام‌شده | نمای نهایی مثبت | نتیجه چه چیزی را ثابت می‌کند |
|---|---|---|---|
| رنگ‌آمیزی ساده (مثلاً فقط متیلن بلو) | هیچ؛ یک رنگ همه سلول‌ها را رنگ می‌کند | سلول‌های آبی با شکلی مشخص | فقط ریخت‌شناسی: شکل و آرایش، بدون طبقه‌بندی |
| رنگ‌آمیزی گرم | مواجهه مجموعه کریستال ویوله-ید با الکل یا استون | بنفش (مثبت) در برابر صورتی (منفی) | رفتار پوشش هنگام استخراج با حلال؛ طبقه‌بندی به دو نوع دیواره |
| رنگ‌آمیزی اسیدفست | مواجهه کربول فوشین واردشده به دیواره‌های مومی با اسید-الکل | قرمز (اسیدفست) در برابر آبی (غیراسیدفست) | حفظ رنگ در برابر اسید-الکل؛ اسیدفست بودن، که با مایکوباکتری‌ها سازگار است اما شناسایی گونه نیست |
برای آشنایی با خانواده گسترده‌تر روش‌های تک‌رنگ باکتریایی، اطلس رنگ‌آمیزی میکروسکوپی را ببینید.
تقابل قرمز و آبی چه چیزهایی را نمی‌تواند ثابت کند
باکتری‌های میله‌ای قرمز نشان می‌دهند که این جانداران در مواجهه با اسید-الکل، کربول فوشین را حفظ کرده‌اند. این یافته با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سازگار است، اما راهنمای تشخیص سل CDC به‌صراحت اشاره می‌کند که سایر مایکوباکتری‌ها نیز اسیدفست هستند؛ بنابراین شناسایی گونه به کشت و آزمایش اسید نوکلئیک نیاز دارد، نه رنگ.
خطاهای اجرایی عمدتاً حول دو مرحله شست‌وشو رخ می‌دهند. رنگ‌زدایی ناکافی مواد زمینه را قرمز باقی می‌گذارد و زمینه تفسیر مثبت کاذب را فراهم می‌کند. رنگ‌زدایی بیش از حد، رنگ اولیه‌ای را که با قدرت کمتری حفظ شده است می‌زداید و به نتایج منفی کاذب کمک می‌کند. استفاده بیش از حد از رنگ متقابل، باسیل‌های کم‌شمار را در زمینه آبی پنهان می‌کند. اسمیرهای ضخیم، رسوب معرف‌ها و آب آلوده برای آبکشی نیز آرتیفکت‌های خود را ایجاد می‌کنند.
هرقدر هم اجرای روش بی‌نقص باشد، تعداد جانداران حساسیت را محدود می‌کند. میکروسکوپی متداول اسمیر تقریباً به 5,000 تا 10,000 باسیل در هر میلی‌لیتر خلط نیاز دارد و مرورهای قدیمی‌تر شواهد CDC، حساسیت اسمیر را در موارد سل ریوی تأییدشده با کشت حدود 45 تا 80 درصد برآورد کرده‌اند. بنابراین اسمیر منفی هرگز سل را رد نمی‌کند. راهنمای کنونی CDC کشت را در کنار هر اسمیر حفظ می‌کند و توصیه می‌کند هنگامی که احتمال سل ریوی مطرح است و نتیجه بر تصمیم‌گیری درباره رسیدگی به بیمار اثر می‌گذارد، آزمایش تکثیر اسید نوکلئیک روی دست‌کم یک نمونه تنفسی انجام شود.
کار عملی باید بر اساس پروتکل‌های مجاز انجام شود
توضیحات آموزشی، از جمله این مقاله، مجوز انجام کار بالینی نیستند. برای کار عملی آزمایشگاهی، از روش اجرایی استاندارد اعتبارسنجی‌شده آزمایشگاه که با اسناد جاری CDC، APHL یا CLSI همسو است پیروی کنید؛ مرجع رنگ‌آمیزی اسیدفست CDC در آرشیو Stacks نشان می‌دهد که این روش‌ها چگونه معرف‌ها و نحوه خواندن نتایج را مشخص می‌کنند. کار با نمونه‌های سل به مهار زیستی نیاز دارد: اسمیرها در کابینت ایمنی زیستی تهیه می‌شوند، زیرا آماده‌سازی باعث ایجاد آئروسل و پاشش می‌شود. راهنمای ایمنی آزمایشگاهی CDC بیان می‌کند که حتی اسمیرهای تثبیت‌شده با حرارت نیز ممکن است حاوی باسیل‌های زنده سل باشند و همچنان باید با آن‌ها به‌عنوان مواد آلوده کار کرد. مدخل کتابخانه تصاویر بهداشت عمومی CDC درباره اسمیر رنگ‌آمیزی‌شده با کربول فوشین و متیلن بلو که برای M. leprae بررسی شده است یادآوری مفیدی از دامنه کاربرد این روش فراتر از سل است: همان کنتراست قرمز روی آبی هرجا که جانداران اسیدفست جست‌وجو شوند کاربرد دارد و یک نتیجه منفی که با بررسی دقیق به دست آمده باشد، خود نتیجه‌ای است که ارزش ثبت کردن دارد.
خواندن لام آماده‌شده
رنگ متقابل هنگام غربالگری ارزش خود را نشان می‌دهد. میکروسکوپیست هنگام بررسی با بزرگ‌نمایی پایین، ابتدا از زمینه آبی برای ارزیابی کیفیت اسمیر استفاده می‌کند: توزیع یکنواخت سلول‌ها، سلول‌های سالم میزبان برای تنظیم فوکوس و نبود رسوب زیاد. سپس موارد قرمز مشکوک توجه را جلب می‌کنند، دقیقاً به این دلیل که هیچ چیز دیگری روی لام قرمز نیست. تأیید با عدسی ایمرسیون روغنی انجام می‌شود؛ در این حالت، باسیل‌های واقعی به شکل میله‌های باریک مورد انتظار، گاهی اندکی خمیده یا دانه‌دانه، دیده می‌شوند، نه به‌صورت بقایای یکنواخت رنگ.
رنگ‌آمیزی زمینه، واژگان گزارش را نیز تعیین می‌کند. لامی که باسیل‌های قرمز دارد با عبارت «باسیل‌های اسیدفست مشاهده شد» گزارش می‌شود و اغلب بر اساس مقیاس آزمایشگاه، درجه‌بندی نیمه‌کمی نیز دارد. لامی که هیچ جاندار قرمزی در آن دیده نمی‌شود با عبارت «باسیل اسیدفست مشاهده نشد» گزارش می‌شود، نه هرگز با عبارت «منفی از نظر سل». این تمایز مهم است، زیرا زمینه آبی نشان می‌دهد که رنگ‌آمیزی انجام شده، سلول‌ها رنگ متقابل را گرفته‌اند و شرایط اپتیکی مناسب بوده است، اما هیچ اطلاعاتی درباره جانداران با تعداد کمتر از حد تشخیص نمی‌دهد. زمینه آبی فاقد باسیل، نتیجه‌ای معتبر درباره لام است، نه حکمی درباره بیمار.
تقسیم وظایف را به خاطر بسپارید تا گزارش‌نویسی روشن شود. کربول فوشین موارد مشکوک را آشکار می‌کند. اسید-الکل آزمون را انجام می‌دهد. متیلن بلو فقط پاسخ را خوانا می‌کند: قرمز رنگ را در برابر اسید حفظ کرده و آبی آن را از دست داده است. هر چیز دیگری، از گونه و تعداد جانداران تا معنای بالینی، از بررسی‌هایی فراتر از لام به دست می‌آید.