Oxigeno-espezie erreaktiboen neurketa metileno urdinaren esperimentuetan

Bi laborategik metileno urdinaren esperimentu antioxidatzailetzat jotzen dutena egiten dute. Batek jakinarazten du tindagaiak oxigeno-espezie erreaktiboak murrizten dituela. Besteak, sortu egiten dituela. Biek dosi-erantzun kurba garbiak erakusten dituzte. Biek zintzotasunez dihardute. Aldea ez da iruzurra edo gaitasunik eza. Bi taldeek gauza desberdinak neurtu dituzte, argiztapen desberdinarekin eta galdera desberdinei erantzuten dieten zundekin, eta gero bi erantzunak hitz berarekin deskribatu dituzte: ROS.

Metileno urdina zehaztasunez neurtzeko molekula zaila da, behatu behar duen kimikan parte hartzen duelako. Ilunpean, elektroiak emaileen eta hartzaileen artean garraiatzen ditu, eta hasierako formara itzultzen da, zikloa berriz hasteko prest. Argiaren pean fotosentsibilizatzaile bihurtzen da, eta triplete egoera kitzikatu batera iristen da; egoera horretatik energia oxigenoari pasa diezaioke oxigeno singletea sortzeko, edo elektroiak transferitu erradikalak eta hidrogeno peroxidoa sortzeko. Sistema horretan jarritako edozein zunda oxidatu, erreduzitu, dekoloratu edo optikoki ezkutatu dezake tindagaiak berak. Beraz, edozein ROS neurketaren lehen galdera ez da inoiz zenbakia zein den. Saiakuntzak benetan zer detektatzen duen da, eta tindagaiak saiakuntzari zer egiten dion.

Amplex Red: hidrogeno peroxidoaren saiakuntza kalibratua

Metileno urdina eta Amplex Red konbinatzea literatura honetako aukerarik sendoena da, behar bezala prestatzen denean. Kimika espezifikoa da: errefau minaren peroxidasak hidrogeno peroxidoa erabiltzen du Amplex substratua produktu fluoreszente batera, erresorufinara, oxidatzeko, gutxi gorabehera bat-bateko estekiometriarekin. Laginetik datorren peroxidoa fluoreszentzia bihurtzen da detektagailuan. ROS familia kanonikoko beste ezerk ez du erreakzio hori zuzenean bultzatzen.

Abantaila erabakigarria kalibrazioa da. Ikertzaile arduratsu batek peroxido-estandar ezagunak neurtzen ditu tanpoi berean, peroxidasa- eta substratu-kontzentrazio berberekin, inkubazio-denbora berarekin eta ezarpen optiko berberekin, eta ondoren laginak kurba horrekin alderatzen ditu. Metodo honen oinarri den garuneko mitokondria isolatuen azterketan, egileek horixe egin zuten: saio bakoitzaren amaieran peroxido kantitate ezagunak gehitu zituzten, eta zenbakiak proteina-miligramoko eta minutuko pikomoletan adierazitako tasa gisa eman zituzten, fluoreszentzia-unitate arbitrarioetan eman beharrean. Horrek bihurtzen du distira bat neurketa.

Azterketa horretako hiru xehetasunek merezi dute eredutzat hartzea. Lehenik, egileek seinalea egiaztatu zuten katalasarekin, peroxidoa suntsitzen duen entzimarekin. Metileno urdinak eragindako fluoreszentzia-igoera eten egin zen katalasa gehitzean; horrek baieztatu zuen seinalea peroxidoarena zela, eta ez artefaktu optiko batena. Bigarrenik, argiztapena zuzenean probatu zuten kitzikapen-izpia obturadore batekin mugatuz, laginek ohiko argi-dosiaren zortziren bat jaso zezaten; seinalea ehuneko bederatzi baino ez zen jaitsi. Jakinarazitako peroxidoaren ehuneko laurogeita hamar baino gehiago neurketako argitik independentea zen. Hirugarrenik, peroxidoaren ezabaketa bereiz neurtu zuten elektrodo batekin, eta tindagaiak ekoizpena handitu eta ezabaketa moteldu egiten zituela aurkitu zuten. Fluoreszentzia garbia soilik adierazten duen zunda batek bi efektu horiek nahastuko zituzkeen.

Saiakuntzak oraindik ere huts egiteko moduak ditu, eta metileno urdinak horietako batzuk azaleratzen ditu. Tindagaiak xurgapen zabala du erresorufinak igortzen duen eskualde gorri berean; beraz, tindagai-kontzentrazio handietan, laginak bere seinalea ezkuta dezake barne-iragazkiaren efektuen bidez. Horregatik, estandarrek laginen tindagai-kontzentrazio bera eduki behar dute. Amplex Red bere kabuz ere fotooxida daiteke, eta haren produktuak, erresorufinak, superoxidoa eta peroxidoa sortzen dituzten fotoredox zikloetan parte har dezake. Horrek garrantzi handia du esperimentuak fotosentsibilizatzaile bat ere argiztatzen duenean. Konponbide praktikoa da lehenik metileno urdinaren laginak irradiatzea eta gero alikuotak Amplex erreaktiboekin ilunpean aztertzea, tindagaia eta zunda batera argiztatu beharrean. Azkenik, superoxido dismutasak ez du Amplex seinalea besterik gabe murrizten: superoxidoa peroxido bihurtzeak seinalea handitu dezake. Fluoreszentzia handitzen duen SOD kontrol batek ez du huts egin. Superoxidoa aurreko urrats bateko espezie gisa identifikatu du.

DCFDA: oxidazio-adierazle ez-espezifikoa

Metileno urdina eta DCFDA konbinazioa da nahasmen gehienaren iturria. DCFH-DA zelula barnera sartzeko aitzindaria da. Zelula barruko esterasek haren azetato-taldeak kentzen dituzte, eta DCFH ez-fluoreszentea uzten dute; DCFH oxidatzeak DCF fluoreszentea sortzen du. Oxidatzen dutenen zerrenda luzea da: hidroxilo erradikalak, peroxidasaren eta hemoaren bitartekoak, nitrogeno dioxidoa, azido hipoklorosoa eta peroxinitritotik eratorritako erradikalak. Hidrogeno peroxidoak bakarrik ez du zuzenean oxidatzen inongo abiadura erabilgarritan; peroxidoaren mendeko fluoreszentziak, oro har, burdina, hemo-proteinak edo peroxidasaren kimika behar ditu prozesuan.

Metodoen atal orok aipatu beharko lukeen kritika Kalyanaramanek eta lankideek DCFH zunda gisa aztertzean egindako analisitik dator, arrazoi horregatik DCFDA baztertu zuen garuneko mitokondrien azterketan laburbildu bezala. Erakutsi zuten tindagaiak poliki erreakzionatzen duela, estekiometria karakterizaturik gabe, baliozko kalibraziorik gabe eta ROS ez diren konposatuekin. Zundak, gainera, neurtzen duena anplifikatzen du: DCFHren elektroi bateko oxidazioak DCF erradikal bat sortzen du, eta horrek oxigenoarekin erreakzionatzen du superoxidoa sortzeko; superoxido hori dismutatu egiten da eta peroxido gehigarria sortzen du. Neurketak berak, neurri batean, adierazten duen kimika sortzen du.

Horrek guztiak ez du DCFDA alferrikako bihurtzen. Baheketa bihurtzen du, ez identifikazioa. DCF fluoreszentziaren igoerak esan nahi du oxidatzaileen mendeko zundaren oxidazioa handitu dela. Ez du esan nahi peroxidoa handitu denik, eta are gutxiago ROS guztien kopurua handitu denik, zunda bakar batek ere neurtzen ez duen kantitatea baita hori. DCF oxidazioan oinarritutako metileno urdinari buruzko lehenagoko lanek, mikromolar batetik gorako kontzentrazioetan, efektu prooxidatzaileak jakinarazi zituzten; garai bereko beste sistema batzuek, berriz, peroxidoak eragindako zelula-heriotzaren aurkako babesa jakinarazi zuten. Bi behaketak egiazkoak izan daitezke tindagai berarentzat redox testuinguru desberdinetan, eta DCF emaitzak bakarrik ezin du esan zein oxidatzailek eraman zuen seinalea. Garuneko mitokondrien lehenagoko lanaren garrantzia da baheketa hori peroxido-neurketa kalibratu batekin ordeztu zuela, eta zama zuzenean agerian jarri zuela: tindagaiaren ehun nanomolarrek ere peroxido-askapena hainbat aldiz handitu zuten probatutako substratu eta arnasketa-egoera guztietan.

DCFDAk metileno urdinari berariaz lotutako beste tranpa bat ere badu. Tindagaiak kolore bizia du eta redox jarduera du; beraz, fluoreszentzia dekoloratu, igorpena moteldu edo zundaren kimika oxidatu dezake, zelulen ROSetatik independentean. Tindagaia eta zunda dituen baina zelularik ez duen kontrol bat ez da hautazko apaingarria. Tindagaiak zundarekin elkarreragiten duen ala ez esaten dizun esperimentua da.

Spin-harrapaketa eta oxigeno-kontsumoa: identitatea eta fluxua

Zunda fluoreszenteek zerbait oxidagarria agertu dela adierazten duten lekuan, spin-harrapatzaileekin egindako elektroi-spinaren erresonantziak zer zen argitzetik hurbilago dagoen informazioa ematen du. Metileno urdinaren fotokimikari buruzko azterketa klasikoak ESR erabili zuen tindagaiak, askorbatoak eta argiak sortutako askorbato erradikala detektatzeko; ondoren, peroxidoaren sorrera erakutsi zuen oxigeno-kontsumoko esperimentuetan, eta burdinak katalizatutako hidroxilo erradikalaren sorrera spin-harrapaketako saioetan. Teknika bakoitzak besteek erantzun ezin zuten galderari erantzun zion: ESRk erradikalaren identitatea eman zuen, oxigeno-kontsumoak edozein zunda fluoreszentetik independentea zen erreakzio-fluxua eman zuen, eta konbinazioak erakutsi zuen oxigeno singletearen bideak eta erradikalen bideak sistema argiztatu berean ari zirela.

1984ko emaitza hori oraindik ere ohartarazpen-etiketa bat bezala irakurtzen da. Argiztapena eta agente erreduzitzaile bat zeudenean, tindagaiak peroxidoa sortzen zuen; eta burdina zegoenean, sistemak hidroxilo erradikala sortzen zuen, multzoko espezierik erreaktiboena. Egileek begiko askorbatoarekin lotu zuten hori, eta erabilera oftalmiko arduragabea zalantzan jarri zuten. Gaur egungo irakurleek kontuan hartu behar dituzte baldintzak: argia gehi erreduzitzailea gehi burdina. Horietako edozein kenduz gero, bidea ahuldu edo desagertu egiten da.

Oxigeno-elektrodoek beste modu batean justifikatzen dute beren lekua. Clark motako elektrodo batek oxigeno-kontsumo garbia neurtzen du; horrek baieztatzen du tindagaiak bultzatutako redox kimika oxigeno molekularra kontsumitzen ari dela, eta fluoreszentzia-artefaktu batek ere faltsutu ezin duen zinetika ematen du. Ez du produktua identifikatzen. Peroxidoa, superoxidoa eta ura sortzeak, baita oxigeno singletearen desaktibazioak ere, oxigenoa kontsumitzen dute. Identitaterik gabeko fluxua fluxurik gabeko identitatea bezain osatugabea da; horregatik, lan sendoek elektrodoa peroxido-saiakuntza kalibratu batekin edo harrapatzaile batekin konbinatzen dute.

Zergatik diren kontraesankorrak antioxidatzaileei buruzko emaitzak

Hiru neurketak elkarren ondoan jarrita, metileno urdinari buruzko literaturako itxurazko kontraesanak metodoen arteko desberdintasunek eta hiru gertakari biologikok azaltzen dituzte.

Lehenik, tindagaia elektroi-garraiatzailea eta peroxido-iturria da aldi berean. Oxigenoa bestela superoxido bihurtuko litzatekeen arnasketa-guneetatik elektroiak desbideratuta, ROS espezie bat murriztu dezake; aldi berean, haren forma erreduzituak oxigenoa zuzenean peroxido bihurtzen du, beste bat handituz. Mitokondrietako redox kimika eta tindagaiaren ordezko bidearen funtzioa aztertzen dituen laborategi batek, beraz, zundaren araberako erantzunak espero beharko lituzke: superoxidoarekiko sentikorra den seinalea jaitsi egiten da, eta peroxidoaren seinalea igo, kubeta berean.

Bigarrenik, dosi txikietan peroxidoa seinale bat da, ez kaltea soilik. Lehenagoko lanari jarraitu zion sagu-garuneko mitokondrien azterketak aurkitu zuen tindagaiaren berrogeita hamar nanomolarrekin ere peroxidoa sortzen zela, maila terapeutikoetan DNA mitokondrialean lesiorik eragin gabe, eta aurretratamenduaren ondoren rotenonak eragindako lesioen aurkako babesa zegoela. Ehun mikromolarrean baino ez, tarte terapeutikotik oso gora, tindagaiak hautatutako DNA zatiak kaltetu zituen; eta argi gorriak gehi tindagaiaren hogei mikromolarrek oxigeno singletea sortu zuten, probatutako zati guztiak kaltetu zituena. Proposatutako mekanismoa hormetikoa da: peroxido-ekoizpen arinak Nrf2ri lotutako defentsa antioxidatzaileak eta biogenesi mitokondriala aktibatzen ditu; beraz, epe laburreko neurketa prooxidatzaile baten ondoren epe luzeagoko emaitza antioxidatzaile bat dator. Ordubetera irakurritako saiakuntza bat eta egun batera irakurritako beste bat bat ez etortzea gerta daiteke, bien artean biologia aldatu delako.

Hirugarrenik, argiak erabakitzen du zein molekula dagoen ere. Argiztapenak tindagaia desmetilatzen du, Azure B eta antzeko produktuetarantz, eta plaka baten gaineko mikroskopio-lanpara nahikoa da tindagaia fotosentsibilizatzeko. Ilunpeko eta argiztatutako esperimentuak esperimentu desberdinak dira, eta edozein protokolotako argiztapenaren eta tindagaiaren maneiuaren kontrolen atalak horrela tratatu behar ditu.

Gutxieneko kontrol-multzoa, eta edozein baieztapen nola interpretatu

Beheko konparazioa artikulu honen jatorrizko erreferentzia-baliabidea da. Metileno urdinaren ROS emaitzaren bat onartu aurretik, egiaztatu egileek zein errenkada bete dituzten eta zein utzi dituzten alde batera.

Hortik interpretazio-arau praktiko bat ondorioztatzen da. Peroxidasarekin erabilitako Amplex kalibratua, katalasarekin egiaztatua, peroxidoari buruzko ebidentzia da. DCFDA zundaren oxidazio ez-espezifikoari buruzko ebidentzia da, eta besterik ez. Erradikalak ezabatzen dituzten agenteen kontrolekin egindako spin-harrapaketa erradikalen identitateari buruzko ebidentzia da. Oxigeno-kontsumoa fluxuari buruzko ebidentzia da. Bere saiakuntzak sostenga dezakeena baino gehiago baieztatzen duen esaldi bat, edozein ziurtasunez idatzita ere, zundari buruzko esaldi bat da, ez tindagaiari buruzkoa. Dosiaren mendekotasunari eta tarte hormetikoari, mitokondrietako elektroi-fluxuari, tindatutako laginetako saiakuntza-interferentziari eta mikroskopiako argiztapen-artefaktuei buruzko lotutako eztabaidek puntu horietako bakoitza zabaltzen dute, eta puntu bakoitzak baliozko izaten jarraitzen du haren behin-behineko erreferentzia ordeztu ondoren.