Metileno-urdinaren tindaketa sinplea eta Gram tindaketa: metodo bakoitzak zer froga dezakeen

Ikasle batek E. coli etiketa duen kultibo batetik frotis bat prestatzen du, metileno-urdinez estaltzen du minutu batez, urez garbitzen du eta olio-immertsioko objektibotik begiratzen du. Bazilo urdinek ikus-eremua betetzen dute. Laborategiko txostenak hau dio: «E. coli gisa identifikatutako bazilo Gram-negatiboak». Behaketa zuzena da. Baina portaobjektibo horrek ez du ondorio hori justifikatzen.

Akatsa kontzeptuala da, ez teknikoa. Ikasleak tindaketa sinplea proba diferentziala balitz bezala tratatu du. Tindaketa sinpleak eta Gram tindaketak galdera desberdinei erantzuten diete, tindaketaren kontzeptu desberdinetan oinarritzen direlako. Batak hau galdetzen du: zer forma dago. Besteak hau: nola jokatzen du zelula-paretak proba baten aurrean. Biak nahastuz gero, ongi tindatutako portaobjektibo batek justifikatu gabeko txosten bat sortzen du.

Alderaketa honek bi metodoak bereizten ditu, emaitza bakoitzak zer baieztatzeko aukera ematen duen erakusten du eta ikasleek gehien egiten dituzten bi galderei erantzuten die: metileno-urdina Gram tindaketan erabil daitekeen, eta E. coli metileno-urdinez tindatzeak benetan zer erakusten duen.

Erantzun laburra

Metileno-urdinaren tindaketa sinpleak urdin beraz koloreztatzen ditu tinda daitezkeen zelula guztiak; beraz, morfologia (baziloak, esferak, espiralak) eta antolamendua (banaka, binaka, kateetan) erakusten ditu, baina ez du Gram kategoriari buruzko ezer adierazten. Gram tindaketak iodoa, dekolorazio-urrats bat eta kontratindagai bat gehitzen ditu; horrela, bakterioak Gram-positibo (more) eta Gram-negatibo (arrosa edo gorri) gisa bereizten ditu, haien estalkiek tindagaia atxikitzeko duten moduaren arabera. Metileno-urdina erabili ondoren bazilo urdinak ikusteak esan nahi du «bazilo-formako zelulak daudela». Gram sekuentzia osoa egin ondoren bazilo arrosak ikusteak esan nahi du «bazilo Gram-negatiboak daudela». Bigarren baieztapenak oinarri sendoagoa du, prozedurak proba gehigarri bat egin duelako.

Artikulu hau tindagai bakarreko bakterio-metodoen familia zabalago batean kokatzen da; familia hori ezagutzeko, ikus mikroskopiako tindaketen atlasa.

Tindaketa sinplea: tindagai bat, galdera bat

Metileno-urdina tindagai basikoa (kationikoa) da. Haren ioi koloredunak karga positiboa du eta zelulako karga negatiboko egiturei lotzen zaie, besteak beste azido nukleikoei eta gainazaleko talde azidoei; ondorioz, zelulak urdin agertzen dira hondo argi baten gainean. OpenStax-ek tindaketa positiboaren printzipio hori azaltzen du tindaketari buruzko kapituluan. Tindagaiaren katioia bera fenotiazina-ioi txiki eta laua da, metileno-urdinaren kimikari buruzko erreferentzian xeheki deskribatua; kloruro kontraioiak ez du koloreztatzen.

Irakaskuntzako protokolo estandar bat nahita da sinplea: egin frotis mehe bat, lehortu airean, finkatu beroz, estali gutxi gorabehera 1% metileno-urdin duen ur-disoluzio batez minutu batez gutxi gorabehera, garbitu leunki urez, lehortu paper xurgatzailez ukituz eta aztertu olio-immertsioz. LibreTexts-eko irakaskuntza-protokolo batek zehazki 1% kontzentrazioko eta minutu bateko prozedura hori ematen du, eta laborategi batzuek denbora luzatzen dutela aipatzen du. Mordenterik ez, dekoloratzailerik ez, bigarren tindagairik ez. Horixe da gakoa. Tindagai bakarra dagoenez eta ezabatze selektiborik ez denez egiten, tindagaiari lotzen zaizkion zelula guztiek kolore bera hartzen dute.

E. coli-ren kasuan, espero den ikus-eremuan bazilo urdinak agertzen dira, banaka, binaka edo multzo txikietan. Urdina tindagaitik dator. Bazilo-forma organismotik dator. Baina konbinazio horrek ez du organismoa identifikatzen, espezie askok bazilo-forma dutelako eta bazilo asko urdinez tindatzen direlako tindaketa sinplean. ATCCk esplizituki azaltzen du morfologiara mugatzen dela, mikrobiologiako kultiboen gidan. Txosten zuzen batek hau dio: «Bazilo urdinak behatu dira». Formatik eta antolamendutik haragoko edozein baieztapenek ebidentzia gehiago behar du.

Gram tindaketa: lau erreaktibo, portaera-proba bat

Gram tindaketa tindaketa diferentziala da. Zelula guztiei sekuentzia bera aplikatzen die, eta ikusten du zein zelulak atxikitzen duten lehen tindagaia eta zeinek galtzen duten. American Society for Microbiology erakundearen Gram tindaketako protokoloek lau urratseko ordena estandarra definitzen dute: kristal-bioleta (tindagai primarioa), Gram iodoa (mordentea), alkohola edo azetona-alkohola (dekoloratzailea) eta, azkenik, safranina (kontratindagaia).

Irakaskuntzako eredu estandarrak bereizketa hori zelula-estalkiaren egituraren bidez azaltzen du. Zelula Gram-positiboek peptidoglikanozko pareta lodia dute; alkoholarekin garbitzean, pareta hori deshidratatu egiten da eta kristal-bioleta eta iodoaren konplexua atxikitzen du. Zelula Gram-negatiboek peptidoglikano-geruza mehea eta lipido askoko kanpo-mintza dute; dekoloratzaileak mintz hori desegituratzen du, eta, ondorioz, konplexua garbitzean kanporatzen da eta zelulek safranina hartzen dute gero. NCBI Bookshelf-eko Gram tindaketaren berrikuspenak zelula-paretan oinarritutako azalpen hori ematen du. Espezialistek eransten dute prozesuaren fisikokimika osoa paretaren lodiera hutsa baino konplexuagoa dela; hala ere, laborategiko interpretaziorako, portaeraren arauak balio du: moreak atxikipena adierazten du; arrosak, galera eta ondorengo kontratindaketa.

Panel ilustratiboak. Metodoak alderatzeko marrazki estilizatuak, ez kameraz egindako mikrografiak. Koloreak sinplifikatuta daude logika irakasteko: kolore bat tindaketa sinplean, bi kolore Gram dekolorazioaren ondoren.

Metileno-urdina Gram tindaketan erabil daitekeen

Galdera horrek bi interpretazio ditu, eta erantzun desberdinak behar dituzte.

Lehen interpretazioa: metileno-urdinez behin estaltzeak Gram sekuentzia osoa ordezka dezakeen. Ez. Iodorik, dekoloratzailerik eta kontratindagairik gabe ez dago urrats diferentzialik; beraz, ez da Gram kategoriarik probatzen. Metileno-urdina bakarrik erabili ondoren ikus-eremu urdin bat agertzea tindaketa sinplearen emaitza da, nahiz eta botila Gram erreaktiboen ondoan egon. Ez erregistratu Gram emaitza gisa.

Bigarren interpretazioa: metileno-urdinak safranina ordezka dezakeen 4. urratseko kontratindagai gisa. Funtzionalki, dekoloratutako zelulak kolorezta ditzake, eta testuliburuko ariketa batek zelula Gram-positibo moreak eta zelula Gram-negatibo urdinak aurreikusten ditu ordezkapen horren ondoren. Logika zuzena da, behar bezala dekoloratutako zelula Gram-negatiboak ia koloregabeak direlako eta beste tindagai kationiko bat hartuko dutelako. Baina ez da protokolo estandarra. ASMren protokoloek safranina zehazten dute, eta aldaera batzuetan fuksina basikoa bezalako alternatiba onartuak aipatzen dituzte, ez metileno-urdina. Gainera, eragozpen praktiko bat dago: urdina moretik bereiztea zailagoa da arrosa moretik bereiztea baino, batez ere hasiberrientzat eta, bereziki, mikroskopio-lanparak ahulduta daudenean. Ikasketa-lanetarako eta garrantzia duen edozein emaitzatarako, erabili zure protokoloak izendatzen duen kontratindagaia, normalean safranina, eta hartu metileno-urdinezko kontratindaketa erakustaldi-aldaera gisa, ez estandar baliokide gisa.

Metileno-urdina tindagai bakarreko beste aukerekin nola alderatzen den azaltzen da bakterioen tindaketa sinpleen alderaketa batean.

E. coli metileno-urdinez tindatzeak zer frogatzen duen, eta zer ez

E. coli bazilo Gram-negatiboa da, baina esaldi horrek hainbat metodotatik datozen datuak uztartzen ditu: morfologia mikroskopiatik, Gram erreakzioa Gram tindaketatik, eta identitatea kultibotik eta proba biokimiko edo molekularretatik. Metileno-urdinez tindatutako frotis batek lehen zatia baino ez du ematen. Tindatutako laginean bazilo-formako zelulak daudela eta nola antolatuta dauden ezartzen du. Ez du Gram erreakzioa ezartzen, ez delako dekolorazio-probarik egin. Ez du espeziea identifikatzen, bereizmen horretan espezie askotako baziloek antzeko itxura dutelako.

Hor egiten dira txostenetako akatsak, modu aurreikusgarrian. Idazleak aurretiko ezagutza («kultibo hau E. coli dela suposatzen da, eta E. coli Gram-negatiboa da») behaketaren lerroan txertatzen du; horrela, portaobjektiboak benetan aurrez suposatutakoa baieztatzen duela dirudi. Txosten argiago batek mailak bereizten ditu: «Metileno-urdinaren tindaketa sinplea: bazilo urdinak behatu dira; morfologia soilik, ez da Gram kategoriarik probatu». Ondoren, Gram tindaketa kontrolekin behar bezala egin bada: «Gram tindaketa: bazilo arrosak, Gram-negatiboekin bat datozenak». Espeziearen identitatea geroago dator, identifikazio-lanaren prozesutik, ez koloretik bakarrik.

Interpretaziorako gida praktikoa

Erabili erabaki-arau hau laborategian. Zelula guztiak kolore berekoak badira eta protokoloan tindagai bakarra erabili bada, dekoloratzailerik gabe, tindaketa sinplea egin duzu. Jaso forma, tamainaren estimazioa eta antolamendua. Gelditu hor. Protokoloak kristal-bioleta, iodoa, dekoloratzailea eta kontratindagaia erabili baditu, kontrol positibo eta negatibo ezagunekin, Gram tindaketa egin duzu. Jaso kolorea eta morfologia: koko moreak kateetan, bazilo arrosak eta abar.

Hiru akatsek azaltzen dute nahasmen gehiena. Lehenengoa, bazilo urdinak E. coli baieztatzeko frogatzat hartzea. Bigarrena, metileno-urdinez tindatutako portaobjektibo bat koadernoan «Gram tindaketa» izenburupean erregistratzea; ondorengo irakurleek gaizki interpretatuko dute hori. Hirugarrena, kontratindagaiak arinkeriaz ordezkatzea eta gero laborategien arteko koloreak alderatzea, kolore-paletak berberak balira bezala. Akats guztiek konponbide bera dute: izendatu benetan egin den metodoa, eta baieztatu metodo horrek probatzen duena soilik.

Tindaketa sinpleak bere lekua merezi du, hain zuzen ere, gutxi baieztatzen duelako. Azkarra da, desbideratze txikiak onartzen ditu eta nahikoa da galdera morfologiari buruzkoa denean: zerbait badago, eta zer forma du. Galdera sailkapenari buruzkoa denean, egin proba diferentziala. Portaobjektibo urdinak zelulek zer itxura duten esaten dizu. Portaobjektibo moreak edo arrosak haien paretek nola jokatzen duten esaten dizu. Batek ere ez dizu, bere kabuz, espeziea zein den esaten.