Metileno urdinaren efektu mitokondrialak neurtzea: oxigenoa, ATP eta mintz-potentziala

Demagun laborategi batek metileno urdina gehitzen diela arnasketa kaltetua duten mitokondriei, eta oxigeno-kontsumoak gora egiten duela ikusten duela. Idazteko esaldi naturala litzateke koloratzaileak funtzio mitokondriala berrezarri duela. Esaldi hori okerra izan daiteke. Oxigeno-fluxua, ATP sintesia eta mintz-potentziala hiru kontzeptu bereizi dira. Organulu bera partekatzen dute, segurtasun-kopiak, sinkronizazioak eta partekatzeak hodeiko karpeta bera partekatzen duten moduan: lotuta daude, baina arau desberdinek gobernatzen dituzte. Bata bestearekin nahastuz gero, interpretazioak huts egiten du, neurketa guztiak teknikoki zuzenak izan arren.

Metileno urdinak nahasketa hori errazten du, neurtzen duen sisteman parte hartzen duelako. Redox-zikloetan aritzen da: katearen goragoko puntuetan elektroiak onartzen ditu eta beheragokoetan ematen ditu; energia-egoeran dauden mitokondrietan metatzen den katioi lipofilikoa da; eta ohiko zunden banda beretan argia xurgatzen eta igortzen duen konposatu urdin bizia da. Neurketa bakar batek ezin du zama hori guztia hartu. Budapesteko azterketa mitokondrialetan ageri den eredu fidagarria oxigeno-fluxua, ATP sintesiaren abiadura, mintz-potentziala eta hidrogeno peroxidoaren askapena neurtzea da, urrats bakoitzean koloratzailearentzako kontrol espezifikoak erabiliz.

Errespirometriak oxigeno-fluxua neurtzen du, ez energia-ekoizpena

Bereizmen handiko errespirometriak, Oroboros Oxygraph bidez nahiz Seahorse zelulaz kanpoko fluxu-analizatzaile bidez eginak, gauza bakar baten berri ematen du: oxigenoa zer abiaduratan erreduzitzen den. Ez du adierazten elektroi bakoitzeko zenbat protoi ponpatu diren, zenbat gradiente kontserbatu den edo ATP sintasak gradiente hori erabili duen.

Terminologia garrantzitsua da. Mitokondria isolatuetan, ADPrik gabeko substratuak ihes-arnasketa ematen du, ADP asetzailearekin dagoen substratuak fosforilazio oxidatiboaren ahalmena ematen du, eta desakoplatzailearen titulazioak elektroi-transferentziaren gehieneko ahalmena ematen du. Zelula osoetan, Seahorse baliokideak hauek dira: arnasketa basala, oligomizinarekiko sentikorra den ATPari lotutako arnasketa, protoi-ihesa, FCCPk definitutako arnasketa maximoa, eta rotenonarekiko eta antimizina-rekiko erresistentea den oxigeno-kontsumo ez-mitokondriala. Seahorse emaitzei 3. egoera eta 4. egoera deitzeak prestakinak bermatzen ez duen zehaztasuna iradokitzen du, Agilent Mito Stress Test esparruak argi uzten duen bezala.

Metileno urdinak oxigeno gehiago eta energia gehiago lotzen dituen intuizioa hausten du. Akurien garuneko mitokondria isolatuetan, koloratzailearen 100 nM eta 1 uM arteko kontzentrazioek atsedeneko oxigeno-kontsumoa handitu zuten glutamatoa eta malatoa, sukzinatoa eta alfa-glizerofosfatoa substratu gisa erabilita; alfa-glizerofosfatoarekin igoera gutxi gorabehera ehuneko 64koa izan zen. Hala ere, ADPk estimulatutako arnasketa ia aldatu gabe geratu zen mitokondria osasuntsuetan, garuneko mitokondria isolatuen azterketaren arabera. Ihes-arnasketa handitu zenez, baina ADPk estimulatutako fluxua bere horretan mantendu zenez, kalkulatutako arnasketa-kontrolaren erlazioa jaitsi egiten da. Jaitsiera horrek ez du esan nahi koloratzaileak mitokondriak kaltetu zituenik. Esan nahi du koloratzaileak oxigenoa kontsumitzen duen redox-ziklo bat gehitu ziola arnasketa normalari. Igoera hori bakarrik jasotzen duen metileno urdinaren oxigeno-kontsumoaren saiakuntzak benetako kimika neurtu du, baina ez du ezer esan energiaren kontserbazioari buruz.

Berreskuratze-esperimentuek alde bera erakusten dute eskala handiagoan. I. konplexua blokeatuta zegoela, oxigeno-fluxua gutxi gorabehera hirukoiztu zen, baina ATP sintesia 1.5 aldiz ingurura baino ez zen igo. Oxigeno gehiago iritsi zen elektrodora. Horren zati txikiagoa erabili zen ATP sortzeko. Fosforilazio oxidatiboa hobetu dela baieztatzeko, ATPren datuak behar dira; ahal dela, oxigeno bakoitzeko ATP erlazio gisa adierazita, izendatzailean erabilitako konbentzioa zehaztuz.

ATP saiakuntzek sintesi-abiadura neurtzen dute; edukiak ezin du hori ordezkatu

ATP saiakuntza batek beste galdera bati erantzuten dio: zenbat ATP sortzen den denbora-unitateko. Neurketa zinetiko batek abiadura ematen du, bai ipurtargi-luziferasaren lumineszentzia minutuz minutuko jarraipenaren bidez, bai 340 nm-an irakurritako hexokinasa eta glukosa-6-fosfato deshidrogenasa saiakuntza akoplatu baten bidez. Amaierako puntu bakarrean egindako ATP totalaren neurketak, berriz, edukia ematen du. Eduki horrek sintesiaren eta kontsumoaren arteko aldea islatzen du, eta berez informazio gutxi ematen du fosforilazio oxidatiboari buruz.

Budapesteko taldeak metodo entzimatiko akoplatua erabili zuen, adenilato kinasaren jarduera inhibituta, eta ikusi zuen 1 eta 2 uM arteko metileno urdinak ATP ekoizpena neurri apalean baina esanguratsuan handitu zuela rotenonaz eta antimizinaz tratatutako mitokondrietan. Benetako berreskuratzea da hori, eta partziala da. TEGDMAren toxikotasunaren azterketak antzeko emaitza lortu zuen beste eredu batean: hortzetan erabiltzen den TEGDMA monomeroaren 5 mM kontzentrazioak I. konplexuari lotutako arnasketa gutxi gorabehera 286 fluxu-unitatetik 28ra jaitsi zuen, eta koloratzailearen 2 uM kontzentrazioak gutxi gorabehera 86ra berreskuratu zuen.

Koloredun redox-konposatu batekin bi kontrol ezinbestekoak dira. Lehenik, erabili oligomizina, neurtutako ATP sintesiaren zer zati dagoen ATP sintasaren mende zehazteko. Bigarrenik, egin zelularik gabeko gehikuntza-berreskuratze proba bat ATP kantitate ezagunarekin, erreaktibo osoarekin eta erabilitako koloratzaile-kontzentrazio zehatzekin; gutxienez, 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM eta 2 uM. Koloratzaileak igorritako argia xurga dezake, entzima adierazlea inhibitu edo erreaktiboaren redox-kimika aldatu. Luziferasa saiakuntzetarako jarraibide orokorrek egiaztapen-saiakuntza biokimiko osagarriak gomendatzen dituzte, hain zuzen, interferentzia mota horretarako. Ez pentsatu 1 uM kontzentrazioak artefakturik ez duenik, fluoreszentzia-itzaltzea kontzentrazio handiagoetan okerragoa izan ohi delako.

Mintz-potentzialaren zundek koloratzailearen banaketa neurtzen dute, ez fluxua

Safranina O, TMRM eta TMRE, rodamina 123 eta JC-1 mintza zeharka dezaketen katioiak dira. Karga negatiboko matrizean metatzen dira oreka elektrokimikoaren arabera; beraz, fluoreszentzia globalak potentzialaren berri zeharka ematen du, zunda non dagoen kontuan hartuta. Horietako batek ere ez du ATP edo elektroi-fluxua neurtzen.

Zunda bakoitzak prestakin egokiago bat du. Safranina O egokia da mitokondria isolatuetarako eta zelula permeabilizatuetarako; normalean, 2 uM inguruan erabiltzen da, kitzikapena 495 nm inguruan eta igorpena 585 nm inguruan dituela, fluoreszentzia-itzaltzeko erregimenean, non barneratzeak fluoreszentzia globala aldatzen duen. TMRM eta TMRE egokiak dira zelula osoetarako, karga nanomolar txikiarekin eta fluoreszentzia-itzaltzerik gabeko moduan: despolarizazioak koloratzailea askatzen du eta fluoreszentzia mitokondriala jaisten da. Karga handiarekin, seinalearen noranzkoa alderantzika daiteke autoitzaltzearen ondorioz. JC-1ek berdearen eta gorriaren arteko erlazio erabilgarria ematen du, baina kargaren eta masa mitokondrialaren mende dago; horregatik, lan kuantitatiboetarako, zorrotz kontrolatutako TMRM baino ahulagoa da. Abantaila eta muga horiek mintz-potentzial mitokondrialaren zunden berrikuspen oso erabili batean laburbiltzen dira.

Metileno urdinak interferentzia optikoa eragiten du, hain zuzen ere, laneko kontzentrazioetan. 600 eta 665 nm inguruko xurgapen-bandak zunda gorrien igorpenarekin gainjartzen dira; beraz, barne-iragazkiaren efektuak, fluoreszentzia-itzaltzea eta kitzikapen-argiaren xurgapena sinesgarriak dira. Koloratzailea, gainera, bigarren katioi lipofiliko bat da, eta haren banaketa ere neurtzen ari den potentzialarekin aldatzen da. Babesa neurketa anizkoitzak eta lagin zuriak erabiltzea da: zunda bakarrik, koloratzailea bakarrik, zunda koloratzailearen kontzentrazio bakoitzarekin, FCCPrekin erabateko despolarizazioa zero-erreferentzia gisa, eta, ahal dela, optikoki desberdina den bigarren zunda bat. III. konplexuaren saihesbidearen azterketak aurrekari hori ezarri zuen: antimizinarekin eta mixotiazolarekin inhibitu ondoren, mintz-potentzialaren berreskuratzea safranina Orekin eta TMRMrekin errepikatu zuen, eta berreskuratze kualitatibo bera lortu zuen. Adierazle optiko bakarra pista bat da. Bi adierazle independente ebidentzia dira.

Hiru prestakin, hiru galdera desberdin

Mitokondria isolatuak, zelula permeabilizatuak eta zelula osoak ez dira saiakuntza bakar baten sentikortasun-doikuntza trukagarriak. Kontzeptu desberdinak dira, funtzionamendu-printzipio desberdinekin.

Mitokondria isolatuek elektroi-garraioaren katea, barne-mintza eta matrizeko makineria mantentzen dituzte, baina mintz plasmatikoa, zitosola eta sarearen arkitektura kentzen dituzte. Kentze hori da helburua: substratuak, ADP, inhibitzaileak eta koloratzaile-kontzentrazioak zehatz-mehatz definituta daude, eta, horrela, bidea identifika daiteke. Ordainetan, jatorrizko substratu-hornidura, seinaleztapena eta eskaria galtzen dira.

Zelula permeabilizatuek mitokondriak beren arkitektura zelularraren zati handi baten barruan mantentzen dituzte, baina kanpotik gehitutako substratuei eta ADPari irekitako mintz plasmatikoa zeharkatzen uzten diete. Tresna egokia dira substratu-bide baten akatsa testuinguru zelular batean kokatzeko. Gehiegizko permeabilizazioak kanpo-mintza kaltetzen du, eta erregulazio zitosolikoa galdu egiten da garbiketarekin.

Zelula osoek dena mantentzen dute: mintz plasmatikoaren hesia, erreduktore zitosolikoak, substratu endogenoen garraioa, sare mitokondriala eta ATP eskaria. Fisiologiatik hurbilen eta mekanismotik urrunen daude, koloratzailearen barneratzeak, erredukzioak eta atxikipenak mitokondrien esposizio eraginkorra baldintzatzen baitute.

TEGDMAren azterketak hiru mailak nahita erabili zituen: garuneko mitokondria isolatuak, koloratzaileak oxidazioa eta potentziala berreskuratzen ote zituen aztertzeko; hortz-mamiko zelula ama permeabilizatuak, batez ere kaltea I. konplexuari lotutako substratuen oxidazioan kokatzeko; eta zelula ama osoak, 2 uM koloratzaileak murriztutako oxigeno-kontsumoan zuen eragin fisiologiko garbia aztertzeko. Prestakin desberdinetako neurketa mitokondrialak alderatzen dituzten irakurleentzat, metileno urdinak elektroiak arnasketa-katean nola mugitzen dituen azaltzen duen artikulu osagarriak bideen testuingurua ematen du, eta metileno urdinaren arnasketa-azterketak irakurtzeko gidak dosien eta inhibitzaileen logika azaltzen du.

Koloratzaile redox-aktibo batek eskatzen dituen kontrolak

Redox-zikloetan aritzen den konposatu batek inhibitzaile arrunt batek baino kontrol-zerrenda luzeagoa behar du, koloratzailearen beraren kimikak biologia imitatu dezakeelako.

Errespirometriarako, erabili tanpoi-soluzioa bakarrik duen ganbera bat deriba neurtzeko, tanpoi-soluzioa eta koloratzailea dituen ganbera bat material biologikorik gabe, koloratzailea saiakuntzan dagoen edozein erreduktore estrazelularrekin, eta amaieran rotenona eta antimizina, zelula osoetako oxigeno-kontsumo ez-mitokondriala definitzeko. Kontuan izan koloratzaile erreduzitua berriz oxidatzen dela elektroiak oxigenoari transferituz, hidrogeno peroxidoa sortzeko. Beraz, elektroi-emailerik gabeko koloratzaile hutsezko lagin zuri batek gutxietsi egiten du NADH edo NADPH eskuragarri dagoenean agertzen den zelularik gabeko oxigeno-kontsumoa.

Hidrogeno peroxidorako, lehenetsi Amplex UltraRed kalibratua eta errefau minaren peroxidasa DCFDA koloratzaile ez-selektiboen aurretik, egiaztatu katalasarekin eta probatu argiztapenarekiko mendekotasuna, koloratzailea fotosentsibilizatzailea baita. Garuneko mitokondrien azterketak ikusi zuen peroxido-karga lau aldiz baino gehiago handitu zela koloratzailearen 100 nM besterik ez erabilita, ezabatzea moteldu egiten zen bitartean; peroxidoa zuzenean sortzen zuen koloratzaile erreduzituak, superoxido-bitartekaririk gabe. Zunden hautaketaren eta argi-kontrolen xehetasunak koloratzaileen esperimentuetan oxigeno-espezie erreaktiboak neurtzeari buruzko artikulu osagarrian azaltzen dira. Peroxidoak noiz jarduten duen seinale gisa eta noiz zama gisa, berriz, zelulen redox-orekarekin eta antioxidatzaileei buruzko baieztapenekin batera lantzen da.

Bideei buruzko baieztapenetarako, probatu III. konplexuaren bi inhibizio-guneak: antimizina A Qi gunean eta mixotiazola Qo gunean; gehitu, halaber, IV. konplexuaren amaierako kontrol bat zianuroarekin. Sagu-garuneko lehenagoko azterketa batek jakinarazi zuen koloratzaileak rotenonak blokeatutako arnasketa berreskuratzen zuela, baina ez antimizinak blokeatutakoa. Geroagoko hiru espezieko azterketak, berriz, berreskuratze partziala aurkitu zuen bi inhibitzaileekin, baita c zitokromoaren zuzeneko erredukzioaren ebidentzia ere. Hartu saihesbidea datu berrienekin bateragarria den azalpen gisa, ez behin betiko frogatutako mekanismo gisa; izan ere, koloratzailearen kontzentrazioak, inhibitzailearen guneak, substratuaren egoerak eta koloratzailearen banaketak behatutako ibilbidea aldatzen dute.

Saiakuntzak hautatzeko matrizea

Erabili taula hau galderatik abiatuta neurketa hautatzeko, eta ez alderantziz.

Gutxieneko baieztapen sinesgarri bat egiteko, koloratzaile-kontzentrazio berak —100 nM, 300 nM, 1 uM eta 2 uM— erabili behar dira honako hauek neurtzeko: oxigeno-fluxua ihes-arnasketako baldintzetan eta ADP, oligomizina eta desakoplatzailea erabilita; ATP sintesiaren abiadura; mintz-potentziala, ahal dela bi zundarekin; eta peroxido-askapen kalibratua, katalasa eta zelularik gabeko kontrolak erabiliz. Eman elkarren artean lotutako multzoa: oxigeno-fluxua, ATP sintesiaren abiadura, oxigeno bakoitzeko ATP, potentziala eta peroxidoa. Zenbaki horietako edozein, bakarrik hartuta, esanahi baten bila dabilen neurketa bat da.