Metileno urdina eta oxido nitrikoa: NOS, cGMP, seinalizazio baskularra

Galderak sinplea dirudi: metileno urdinak oxido nitrikoa inhibitzen al du? Laborategian, erantzuna lau galdera bereizitan banatzen da, eta bakoitzak proba esperimental desberdin bat du. Horiek nahastea da metileno urdinari eta oxido nitrikoari buruzko testuak ziurrak baina lausoak izatearen arrazoi nagusia.

Irudikatu oxido nitrikoaren seinalea lau katebegiko kate gisa. Gene bat transkribatzen da oxido nitriko sintasa sortzeko. Entzimak arginina oxido nitriko bihurtzen du. Gasa bere xedera barreiatzen da beste zerbaitekin erreakzionatu aurretik. Guanilato ziklasa disolbagarriak detektatu egiten du eta GMP ziklikoa sortzen du. Metileno urdinak katebegi guztietan dituen eraginak argitaratu dira, baina ebidentzia prestakin, kontzentrazio eta isoforma desberdinetatik dator. Katebegi bateko emaitzak ez du frogatzen beste batean eragiten duenik.

Kate kanonikoa, argi azalduta

Odol-hodi baten horman, ohiko sekuentzia honela gertatzen da. Estimulu batek zelula endotelial batean eragiten du. Oxido nitriko sintasa endotelialak, eNOS edo NOS3 deritzonak, oxido nitrikoaren pultsu txiki bat sortzen du. Gasa aldameneko muskulu leuneko zelulara barreiatzen da, guanilato ziklasa disolbagarriaren hemo taldeko burdina erreduzituari lotzen zaio, eta GTP GMP zikliko bihurtzea bizkortzen du. GMP ziklikoak G proteina kinasa aktibatzen du, kaltzioaren kudeaketa aldatzen da, eta muskulua erlaxatu egiten da.

Bereizita mantentzea merezi duen bigarren kate bat dago. Infekzio batean edo zitokinen eraginpean, zelulek beste entzima bat transkribatzen dute: oxido nitriko sintasa induzigarria edo iNOS, NOS2 ere deitua. eNOSek baino oxido nitriko fluxu handiagoak eta iraunkorragoak sortzen ditu. Hirugarren isoforma bat, NOS neuronala edo nNOS, beste testuinguru bati dagokio. Artikulu batek oxido nitriko sintasa aipatzen duenean isoforma zehaztu gabe, gelditu eta egiaztatu zein neurtu den. Metileno urdinak elektroiak nola mugitzen dituen azaltzen duen ikuspegi orokorrak puntu bera azpimarratzen du erredox xedeetarako oro har: bitartekariak ez du ezer egiten bere kabuz, eta mutur bakoitzeko partaideak zehazten du emaitza.

Neurtutako GMP ziklikoa ere adierazle integratua da, ez entzimaren zuzeneko saiakuntza. Haren mailak ziklasak egindako sintesia ken fosfodiesterasek eragindako degradazioa islatzen du; muskulu leun baskularrean, bereziki PDE5ek eragindakoa. Beraz, GMP ziklikoa jaisteak esan nahi du seinale gutxiago iritsi dela detektagailura. Berez, ez du zehazten zein katebegik huts egin duen.

1. katebegia: iNOS entzima gutxiago sortzen da

Bakterioen lipopolisakaridoarekin, gamma interferonarekin edo biekin estimulatutako sagu-makrofagoetan, metileno urdinak iNOS proteinaren espero zen igoera eragotzi zuen, eta iNOSen RNA mezularia nabarmen murriztu zuen makrofagoen transkripzio-esperimentuetan. Aldatu ez zena da informaziorik esanguratsuena ematen duena. I kappa B alfa inhibitzailearen degradazioa, NF kappa B eta STAT1en fosforilazioa eta faktore horien nukleorako mugimendua neurri handi batean bere horretan mantendu ziren. Jaitsi zena DNAri lotzea izan zen; kromatinaren immunoprezipitazioak baieztatu zuen hori, iNOSen promotorean okupazio txikiagoa erakutsita.

Gene-erregulazioko eragin bat da hori, entzima kantitatea zehaztu aurreko urratsean gertatzen dena, ez lehendik dagoen entzima baten berehalako blokeoa. Hanturazko seinalizazioari dagokio, non transkripzio-faktoreek promotore bati lotu behar dioten proteina agertu aurretik. Ez du ezer zuzenik adierazten atsedeneko odol-hodi bateko eNOS konstitutiboari buruz, eta horrela deskribatu behar da.

2. katebegia: lehendik dagoen NOS entzimak motelago jarduten du

Arratoiekin egindako ikerketa batek beste maila bat aztertu zuen. Konortea zuten arratoi arrei lipopolisakaridoa eman zitzaien zain barnean; hiru ordu geroago, gatz-disoluzioa edo metileno urdina eman zitzaien zain barnean, azken hori kg bakoitzeko 3 mg-ko dosian. Hipotalamoaren erdialdeko oinarri-eremuan oxido nitriko sintasaren jarduera neurtu zen, markatutako arginina zitrulina bihurtzea aztertuz, hipotalamoko NOS jardueraren ikerketan. Estresak eta gatz-disoluzioak bakarrik kaltzioarekiko independentea zen jarduera apur bat induzitu zuten, eta lipopolisakaridoak kontrol-mailaren hamar halakora igo zuen gutxi gorabehera. Metileno urdinak induzitutako bi osagaiak ezabatu zituen. Kaltzioaren mendeko jarduera konstitutiboa ez zen aldatu ehun horretan, dosi eta denbora-puntu horietan.

Irakurri emaitza hori idatzita dagoen bezala: neurtutako iNOS motako jarduera murriztu zen baldintza horietan. Ez da gene-adierazpenaren neurketa bat, eta ez du frogatzen iNOSekiko selektibitatea iraunkorra denik eNOSen edo nNOSen aldean. Entzima araztuekin egindako lanak zuhurtzia hori indartzen du. Oxido nitriko sintasa araztuaren zuzeneko saiakuntzetan, metileno urdinak erabat blokeatu zuen zitrulinaren sorrera 30 mikromolarreko kontzentrazioan; inhibizio erdiko kontzentrazioa 5.3 mikromolar ingurukoa izan zen superoxido dismutasarik gabe, eta 9.2 mikromolarrekoa harekin, NOS araztuaren eta guanilato ziklasaren konparazioan jakinarazi zenez. nNOS araztuarekin egindako beste ikerketa batek entzimari lotutako hemoaren oxidazioa tarteko zela adierazi zuen. Ondorio praktikoa da NOSen zuzeneko inhibizioa benetakoa dela sistema isolatuetan, baina hipotalamoko emaitza ezin dela orokortu metileno urdinak NOS konstitutibo guztiak nonahi ukitu gabe uzten dituela esateko.

3. katebegia: oxido nitrikoa iritsi aurretik galtzen da

Entzimaren blokeoaz bestelako zerbaitek GMP ziklikoaren jaitsiera azal dezakeela erakusten duen frogarik argiena kultibatutako untxi-birikako arterien muskulu leuneko zeluletatik dator. Diseinuak NOS endogenoa guztiz saihestu zuen oxido nitriko emaileak zuzenean gehituz, eta gero aztertu zuen ea metileno urdinak oraindik GMP ziklikoaren erantzuna murrizten zuen, muskulu leun baskularreko superoxidoaren ikerketan.

Hiru emaile probatu ziren 1 eta 100 mikromolar artean: S nitroso L zisteina, sodio nitroprusiatoa eta MPANO izeneko analogo desaminatu egonkor bat. Guztiek igo zuten GMP ziklikoa, gutxi gorabehera 1.5 eta 12 aldiz artean. Metileno urdinak, 10 mikromolarreko kontzentrazioan, lehenengo bien erantzuna ehuneko 51 eta 100 artean inhibitu zuen, eta MPANOren erantzuna aldatu gabe utzi zuen. Metileno urdinak ziklasaren gune katalitikoa soilik blokeatuko balu, emaileekiko selektibitate hori azaltzea zaila litzateke, hirurek beheragoko entzima berean bat egiten baitute.

Ondoren, hiru kontrolek superoxidoari lotu zioten mekanismoa. Lehenik, xantina eta xantina oxidasa erabiliz zelulaz kanpoko superoxidoa sortzeak eredu bera erreproduzitu zuen: CYSNO eta nitroprusiatoa blokeatuta, MPANO ukitu gabe. Bigarrenik, metileno urdinak dosiaren eta denboraren mendeko superoxido-ekoizpena eragin zuen muskulu leuneko zeluletan, c zitokromoaren erredukzioaren bidez neurtuta. Hirugarrenik, superoxido dismutasak erabat eragotzi zuen inhibizioa, baina katalasak ez; horrek adierazten du prestakin horretan eraginaren hurbileko espeziea superoxidoa zela, eta ez hidrogeno peroxidoa.

Esperimentuaren kokultiboko bertsioa azaltzea merezi du, eragina espazioan kokatzen duelako. Estalki-beiren gaineko zelula endotelialak muskulu leuneko zelulekin batera kultibatu ziren denbora labur batez; horrela, oinarrizko baldintzetan askatutako faktore endotelialak hiru eta zortzi aldiz artean igo zuen muskulu leuneko GMP ziklikoa. Konpartimentu bietako edozein metileno urdinarekin aurrez tratatzeak seinale hori murriztu zuen, eta superoxido dismutasak partzialki lehengoratu zuen aurretratamendu endotelialaren eragina. Beste era batera esanda, metileno urdinak ez du zertan muskulu leuneko zelula detektagailuaren barruan eragin. Seinalea murriztu dezake mezularia bidean ezabatuz. Metileno urdinaren ikerketak irakurtzeko gidak arau orokortzat hartzen du hori: xede molekular bat izendatu aurretik, adierazi zein konpartimentutan egin den esku-hartzea.

Horri NOS inhibizioa deitzea okerra litzateke. Emaileek funtzionatzeko ez zen sintasa-urratsik behar, eta hala ere seinalea jaitsi egin zen.

4. katebegia: detektagailuak berak erantzun txikiagoa ematen du

Guanilato ziklasa disolbagarriaren gaineko zuzeneko eraginak badaude, baina kontzentrazioek garrantzia dute. Goian aipatutako entzima araztuen konparazioan, oxido nitrikoak estimulatutako ziklasak 60 mikromolar inguruko metileno urdinaren kontzentrazioa behar izan zuen inhibizio erdirako; NOSen inhibizio erdia, berriz, 5 eta 9 mikromolar inguruan gertatu zen, eta 1 milimolarreko kontzentrazioak ere blokeo maximo partziala baino ez zuen eragin. Horrek gutxi gorabehera sei eta hamaika aldiz arteko aldea adierazten du. Beraz, kontzentrazio mikromolar baxuan GMP ziklikoa murrizten duen zelula-esperimentu bat ezin da ziklasaren inhibizio selektibotzat jo GMP ziklikoaren balioan soilik oinarrituta.

Geroagoko erredox ikerketa batek bigarren ohartarazpen bat gehitu zuen: metileno urdinak oxido nitrikoak aktibatutako ziklasa desaktibatu zuen, hemoaren burdina airez oxidatze hutsetik bereizitako mekanismo baten bidez. Hortaz, detektagailuaren funtzioa kaltetu daiteke, baina kimika ez dago argituta, eta kontzentrazioen arteko aldeak esan nahi du kontzentrazio mikromolar baxuetako esposizioetan superoxidoaren eta NOSen eraginak lehenik baztertu behar direla. Hemen ere sartzen da fosfodiesterasaren kontrola. Degradazioa neurtu edo blokeatu ezean, GMP ziklikoaren metaketa txikiagoa bateragarria da sintesi txikiagoarekin, degradazio azkarragoarekin edo biekin.

Zergatik ezin den hori odol-presioari buruzko baieztapen bakar batera mugatu

Katebegi bakoitza sistema desberdin batean egiaztatu zen. Makrofagoen transkripzioa ez da hipotalamoko entzima-jarduera. Lipopolisakaridoaren ondorengo hipotalamoko jarduera ez da atsedeneko tonu endoteliala. Kokultiboan oinarrizko baldintzetan askatutako faktore endoteliala ez da agonista batek estimulatutako basodilatazioa. Metileno urdinaren 10 mikromolarreko kontzentrazioan kultibatutako birika-arterietako zelulak ez dira giza zirkulazioa. Hori guztia metileno urdinak oxido nitrikoa blokeatuz odol-presioa igotzen duela dioen baieztapen batera laburtzeak baztertu egiten ditu kontrolek gordetzeko diseinatu zituzten bereizketak, hain zuzen ere.

Hiru egiaztapenek azalpenaren zehaztasuna bermatzen dute. Lehenik, izendatu isoforma: eNOS atsedeneko tonu baskularrerako, iNOS induzitutako hanturazko fluxurako, eta nNOS testuinguru neuronaletarako eta entzima araztuen testuinguru batzuetarako. Bigarrenik, adierazi nola iristen den oxido nitrikoaren seinalea: sintesi endogenoa, oinarrizko askapen endoteliala edo emaile jakin bat, hala nola CYSNO, nitroprusiatoa edo MPANO; izan ere, emaile egonkorrak metileno urdinaren eraginari eutsi zion, baina labilak zirenek ez. Hirugarrenik, adierazi kontzentrazioa eta lehengoratzea: superoxido dismutasak erantzuna lehengoratzeak superoxidoa tarteko dela adierazten du; katalasak huts egiteak hidrogeno peroxidoaren aurkako ebidentzia ematen du prestakin horretan; xantina oxidasak eragina imitatzeak nahikoa dela erakusten du; eta entzima araztuen saiakuntzek katalisiaren zuzeneko eraginak bidean gertatutako galeretatik bereizten dituzte.

Laburpena hau da. Hobe da metileno urdina oxido nitrikotik GMP ziklikora doan seinalizazioaren hainbat puntutan eragiten duen perturbatzaile gisa hartzea, ziklasaren blokeatzaile selektibo gisa baino. Prestakinaren eta kontzentrazioaren arabera, iNOSen transkripzio-faktoreen lotura murriztu dezake, NOS entzimak zuzenean inhibitu, superoxidoa sortuz oxido nitrikoaren erabilgarritasuna gutxitu, eta oxido nitrikoak aktibatutako ziklasaren funtzioa kaltetu. GMP ziklikoaren seinalizazioak ikerketa baskularretan duen eginkizunak eta zelula-saiakuntzetan erabilitako oxido nitriko emaileen konparazioak adar horietako bana xehetasun handiagoz lantzen dute, eta erredox eraginak entzimen eraginetatik bereizteko erabilitako metodoei buruzko azalpenak argitzen du zergatik agertzen diren hain maiz literatura honetan superoxido dismutasa, katalasa eta emaile egonkor baten kontrola batera.

Metileno urdinaren ondorengo GMP ziklikoaren balio baxu batek kate hautsi bat identifikatzen du. Kontrolek soilik esaten dute zein katebegi hautsi den.