Artikulua
Zergatik erabiltzen den metileno-urdina azidoarekiko erresistenteen kontratindatzaile gisa
Teknikari batek esputo-frotis bat aztertzen du tindaketa-sekuentzia osoaren ondoren. Makila gorriak hondo urdinaren gainean nabarmentzen dira, eta txostenean azidoarekiko erresistenteak diren baziloak ikusi direla adierazten da. Hurrengo egunean, beste portaobjektu batek eremu urdin uniformea erakusten du, makila gorririk gabe, eta tuberkulosirako negatibo gisa ematen da emaitza. Txosten horietako batek portaobjektuak justifikatzen duena baino gehiago baieztatzen du, eta ez da lehenengoa.
Nahasmena kontzeptuala da. Teknikariak koloratzaile urdina detekzioaren kimikaren parte balitz bezala ulertu zuen, metileno-urdinak mikobakterioak aurkitzen lagunduko balu bezala. Ez zuen horretan lagundu. Metileno-urdinak portaobjektua ukitzen duenerako, proba amaituta dago jada. Koloratzaileak hondoa baino ez du koloreztatzen, emaitza irakurgarria izan dadin. Artikulu honek azaltzen du metileno-urdinaren helburua azidoarekiko erresistentziaren tindaketan, zergatik den urdina eta ez beste edozein koloretakoa, eta zer ondorio atera daitezkeen hondo urdinaren gaineko gorritik.
Erantzun laburra
Azidoarekiko erresistentziaren tindaketa hiru ideiatan oinarritutako proba diferentziala da. Karbolfuksina, koloratzaile nagusia, zelula guztietan sartzera behartzen da, argizarizko estalkia duten mikobakterioetan ere bai. Azido-alkoholak, dekoloratzaileak, koloratzaile gorria zelula arruntetatik kentzen du, baina ezin du azidoarekiko erresistenteak direnetatik atera. Ondoren, metileno-urdinak, kontratindatzaileak, dekoloratzaileak kolorerik gabe utzi duen guztia koloreztatzen du; horrela, azidoarekiko erresistenteak ez diren zelulak, ostalariaren zelulak eta hondakinak urdin agertzen dira, eta azidoarekiko erresistenteak diren baziloek gorri jarraitzen dute. Kontratindatzaileak kontrastea ematen du. Ez du inolako eginkizunik zelula bat azidoarekiko erresistente egiten duen kimikan.
Urrats bakoitzaren eginkizuna
Beheko diagramak eginkizunen banaketa erakusten du. Irakurri ezkerretik eskuinera, prozedura gisa, eta beheko zerrenda tindaketa-familia bakoitzak galdera desberdin bati erantzuten diola gogoratzeko.
Sartzea da lehen urratsa. Mikobakterioek uretako koloratzaile arruntei aurre egiten diete, haien estalkia ohiz kanpo hidrofoboa delako; horregatik, protokoloak sarrera behartzen du. Ziehl-Neelsen metodoan, lurruna sortzeraino berotzeak fenola duen karbolfuksina argizarizko paretan zehar sartzea eragiten du. Kinyoun metodo hotzean, beroaren ordez koloratzaile nagusiaren formulazio askoz indartsuagoa erabiltzen da, eta berorik gabeko bertsio aldatu batzuek surfaktanteak gehitzen dituzte. American Society for Microbiology erakundearen azidoarekiko erresistentziaren tindaketa-protokoloek bi formulazioak elkarren ondoan dokumentatzen dituzte, eta kontzentrazio-aldea nabarmena da: gutxi gorabehera 0.3 g fuksina basiko 100 mL bakoitzeko metodo berotuan, eta 4 g inguru metodo hotzean.
Bereizketa da bigarren urratsa. Azido-alkoholak, normalean 3 mL azido klorhidriko kontzentratu 97 mL ehuneko 95eko etanoletan, koloratzaile gorria kentzen du paretak erresistentzia berezirik eskaintzen ez duen zelula orotatik. Mikobakterioen estalki lipidikoa osorik duten zelulek koloratzaileari eusten diote. Metodo osoaren funtsezko urratsa da hori, eta teknikaren eraginarekiko sentikorrena ere bai, beherago azalduko denez.
Kontrastea da azken urratsa. Portaobjektuan, azidoarekiko erresistenteak diren zelula gorriak daude orain, koloratzailea galdu duten zelulen ia kolorerik gabeko hondoaren gainean. Ehuneko 0.3 w/v-ko metileno-urdinak hondo hori berriro ikusgai egiten du, gorritik ahalik eta urrunen dagoen kolore batean. Kontratindaketa laburra da: normalean 20 eta 30 segundo artekoa metodo berotuan, eta zenbait minutura artekoa metodo hotzaren aldaera batzuetan. Iraupena protokoloaren araberakoa da, ez koloratzailearen berezko propietate bat.
Zergatik koloratzaile hau, eta zergatik urdina
Metileno-urdina koloratzaile basiko kationikoa da; hau da, haren ioi koloredunak karga positiboa du, eta dekoloratutako bakterioen, ostalariaren zelulen eta hondakinen karga negatiboko gainazalei lotzen zaie. OpenStax Microbiology lanak kargen logika hori koloratzaile basikoen printzipio orokor gisa azaltzen du. Baina metileno-urdina ez da kimikoki bakarra eginkizun horretan. Kristal-bioleta eta safranina ere koloratzaile basikoak dira. Hautua optikoa da, ez kimikoa.
Makila gorriek kontrastea egiten duen tonuko hondo bat behar dute, eta urdina gorriaren kontrakoa da eremu argiko mikroskopiarako modurik erabilgarrienean. Safranina kontratindatzaile eskasa litzateke, ematen duen azken kolore arrosa-gorria atxikitako karbolfuksinaren koloretik hurbilegi dagoelako, prozedurak sortutako bereizketa bera ezabatuz. Kristal-bioletak hondo bioleta iluna emango luke, bazilo gorri meheekin arretagatik lehiatuko litzatekeena. Eginkizuna kontrastea dela, eta ez kimika, frogatzen duen ebidentziarik sendoena ordezkapena da: malakita-berdea eta berde distiratsua bezalako kontratindatzaile berdeak erabiltzen dira albaitaritzako protokolo batzuetan eta protokolo aldatuetan, eta probak funtzionatzen jarraitzen du, argi eta garbi desberdina den edozein tonuk eginkizun bera betetzen duelako.
Hortik bi ondorio praktiko datoz. Lehenik, errezeta estandarrak ez du pH-doikuntzarik zehazten; ez nahastu ehuneko 0.3ko ur-disoluzio soil hau Loefflerren metileno-urdina bezalako formulazio alkalinoekin, beste tindaketa-kontzeptu bati dagozkio eta. Bigarrenik, gehiegikeriak kalte egiten du. Histologiako literaturak berariaz ohartarazten du hondo urdin trinkoegiak bazilo urriak ezkuta ditzakeela; beraz, portaobjektua protokoloak baimentzen duen baino denbora luzeagoz koloratzailez estalita edukitzeak irakurgarritasuna galtzea dakar, trukean ezer irabazi gabe.
Proba ahalbidetzen duen paretaren kimika
Azido-alkoholak bereizteko duen gaitasunaren arrazoia mikobakterioen estalkian dago. Haren egiturazko muina mikolil-arabinogalaktano-peptidoglikano konplexua da: peptidoglikanoa arabinogalaktanoari lotuta dago, eta azken horren kanpoko muturrek kate oso luzeko azido mikolikoak daramatzate. Horrela, lipidotan aberatsa den kanpoko mikomintza osatzen da, ohiz kanpo iragazkortasun txikikoa. Mikobakterioen kanpoko mintzari buruzko berrikuspenak arkitektura hori zehazten du. Hesiak bi noranzkoetan jarduten du. Koloratzailearen sarrerari aurre egiten dio, eta horregatik behar dira beroa edo koloratzaile nagusi indartu bat sartzea lortzeko; koloratzailearen erauzketari ere aurre egiten dio, eta horregatik azido-alkoholak ezin du karbolfuksina kendu barruan dagoenean. Bakterio arruntek ez dute estalki hori, eta koloratzailea galtzen dute. Beraz, azidoarekiko erresistentzia hobeto ulertzen da hesi lipidikoaren fenomeno gisa, eta ez fuksina azido mikolikoari kimikoki lotzen zaion fenomeno gisa.
Kimika horrek ohiko zalantza bat ere argitzen du: mikobakterioak gaizki eta modu aurresanezinean tindatzen dira Gram metodoarekin; batzuetan, ale-itxurako forma ahul gisa edo tindatu gabeko itzal gisa agertzen dira. Haien pareta hidrofoboak kristal-bioletaren sarrera mugatzen du. Azidoarekiko erresistentziaren tindaketa ez da Gram tindaketa aldatu bat. Beste printzipio diferentzial bat da, paretaren beste propietate batean oinarritua, tindaketa sinplearen eta Gram tindaketaren arteko alderaketak beste bi metodoetarako erakusten duen bezala.
Hiru metodo, hiru galdera
| Metodoa | Egindako proba | Azken emaitza positiboa | Emaitzak zer frogatzen duen |
|---|---|---|---|
| Tindaketa sinplea (adibidez, metileno-urdina bakarrik) | Bat ere ez; koloratzaile batek zelula guztiak koloreztatzen ditu | Forma jakin bateko zelula urdinak | Morfologia soilik: forma eta antolamendua, sailkapenik gabe |
| Gram tindaketa | Kristal-bioleta eta iodoaren konplexua alkoholaren edo azetonaren eraginpean jartzea | Morea (positiboa) eta arrosa (negatiboa) | Estalkiaren portaera disolbatzaile bidezko erauzketan; bi pareta motatan sailkatzea |
| Azidoarekiko erresistentziaren tindaketa | Argizarizko paretetan behartuta sartutako karbolfuksina azido-alkoholaren eraginpean jartzea | Gorria (azidoarekiko erresistentea) eta urdina (azidoarekiko erresistentea ez dena) | Azido-alkoholaren aurreko atxikipena; azidoarekiko erresistentzia, mikobakterioekin bateragarria dena baina espeziearen identifikazioa ez dena |
Koloratzaile bakarreko bakterio-metodoen familia zabalagoa ezagutzeko, ikusi mikroskopiako tindaketen atlasa.
Hondo urdinaren gaineko gorriak ezin duena frogatu
Makila gorriek esan nahi dute organismoek karbolfuksinari eutsi diotela azido-alkoholaren eraginpean. Aurkikuntza hori bateragarria da Mycobacterium tuberculosis-ekin, baina CDCren tuberkulosiaren diagnostikorako gidalerroek berariaz adierazten dute beste mikobakterio batzuk ere azidoarekiko erresistenteak direla; beraz, espeziea identifikatzeko kultiboa eta azido nukleikoen probak behar dira, ez kolorea.
Teknika-akatsak bi garbiketa-urratsen inguruan pilatzen dira. Dekolorazio eskasak hondoko materiala gorri uzten du, eta positibo faltsuak irakurtzea errazten du. Gehiegizko dekolorazioak ahul atxikitako koloratzaile nagusia kentzen du, eta negatibo faltsuak eragiten laguntzen du. Gehiegi aplikatutako kontratindatzaileak bazilo urriak urdinaren azpian ezkutatzen ditu. Frotis lodiek, hauspeatutako erreaktiboek eta kutsatutako garbitzeko urak beren artefaktuak gehitzen dituzte.
Sentikortasuna organismo-kopuruak mugatzen du, teknika zein garbi gauzatzen den gorabehera. Frotisaren mikroskopia konbentzionalak gutxi gorabehera 5,000 eta 10,000 bazilo artean behar ditu esputoaren mililitro bakoitzeko, eta CDCren ebidentziaren berrikuspen zaharragoek frotisaren sentikortasuna ehuneko 45 eta 80 artean kokatzen zuten kultibo bidez baieztatutako biriketako kasuetan. Beraz, frotis negatibo batek ez du inoiz tuberkulosia baztertzen. CDCren egungo gidalerroek frotis bakoitzarekin batera kultiboa mantentzen dute, eta azido nukleikoen anplifikazio-probak gomendatzen dituzte gutxienez arnas lagin batean, biriketako tuberkulosia susmatzen denean eta emaitzak kudeaketa aldatuko lukeenean.
Lan praktikoa baimendutako protokoloen arabera egin behar da
Irakaskuntzarako deskribapenek, artikulu hau barne, ez dute lan klinikoa egiteko baimenik ematen. Laborategiko lan praktikorako, jarraitu laborategiaren baliozkotutako jardun-prozedura estandarrari, CDC, APHL edo CLSIren egungo dokumentuekin bat datorrenari; CDCren Stacks artxiboan gordetako azidoarekiko erresistentziaren tindaketari buruzko erreferentziak erakusten du prozedura horiek nola zehazten dituzten erreaktiboak eta emaitzen irakurketa. Tuberkulosi-laginekin lan egiteak euste-neurriak eskatzen ditu: frotisak segurtasun biologikoko kabina batean prestatzen dira, prestaketak aerosolak eta zipriztinak sortzen dituelako. CDCren laborategiko segurtasun-gidalerroek adierazten dute beroz finkatutako frotisek ere tuberkulosi-bazilo bideragarriak izan ditzaketela, eta kutsatuta baleude bezala manipulatu behar direla oraindik. CDCren Public Health Image Library bildumako sarrerak, M. leprae bilatzeko aztertutako karbolfuksina eta metileno-urdinarekin tindatutako frotis bati buruzkoak, metodoaren erabilera-eremua tuberkulosiaz harago doala gogorarazten du: hondo urdinaren gaineko gorriaren kontraste bera erabiltzen da azidoarekiko erresistenteak diren organismoak bilatzen diren guztietan, eta arretaz egindako irakurketa negatiboa bera ere erregistratzea merezi duen emaitza da.
Amaitutako portaobjektua irakurtzea
Kontratindatzaileak miaketan erakusten du bere balioa. Handitze txikian aztertzen ari den mikroskopistak lehenik hondo urdina erabiltzen du frotisaren kalitatea ebaluatzeko: zelulen banaketa uniformea, fokuratzeko ostalariaren zelula osoak eta hauspeakin handirik eza. Ondoren, hautagai gorriek arreta erakartzen dute, hain zuzen ere portaobjektuan beste ezer ez delako gorria. Baieztapena olio-murgilketan egiten da; hor, benetako baziloek espero diren makila meheak erakusten dituzte, batzuetan zertxobait kurbatuak edo ale-itxurakoak, koloratzaile-hondakin uniformeen ordez.
Hondoaren tindaketak txostenaren hiztegia ere ezartzen du. Bazilo gorriak dituen portaobjektu baten txostenean azidoarekiko erresistenteak diren baziloak ikusi direla adierazten da, sarritan laborategiaren eskalaren araberako maila erdikuantitatibo batekin. Organismo gorririk ez duen portaobjektu baten txostenean azidoarekiko erresistenteak diren bazilorik ez dela ikusi adierazten da, inoiz ez tuberkulosirako negatiboa dela. Bereizketa hori garrantzitsua da, eremu urdinak frogatzen duelako tindaketak funtzionatu duela, zelulek kontratindatzailea hartu dutela eta optika egokia izan dela, baina ez duelako ezer esaten detekzio-mugatik behera dauden organismoei buruz. Eremu urdin huts bat portaobjektuari buruzko emaitza baliozkoa da, ez pazienteari buruzko epaia.
Gogoan izan eginkizunen banaketa, eta txostenak berez idatziko dira. Karbolfuksinak hautagaiak detektatzen ditu. Azido-alkoholak proba egiten du. Metileno-urdinak erantzuna irakurgarri baino ez du egiten: gorriak koloratzaileari eutsi zion azidoaren aurrean; urdinak galdu egin zuen. Gainerako guztia, espeziea, organismo-kopurua eta esanahi klinikoa, portaobjektutik haragoko lanetik dator.