Metileno urdina eta autofagia: AMPK, mTOR eta neuronetako esperimentuak

Imajinatu zelulekin esperimentu bat egiten duzula, metileno urdina gehitzen duzula eta zure immunoblotean LC3-II izeneko proteina-banda iluntzen dela ikusten duzula. Tentagarria da konposatuak «autofagia bultzatzen duela» iragarri eta aurrera egitea. Interpretazio hori goiztiarra da. LC3-II banda ilunago batek esan dezake zelula garbiketarako besikula gehiago eraikitzen ari dela, edo besikulak pilatzen ari direla, hondakinak ezabatzeko urratsa trabatuta dagoelako. Bi interpretazioek kontrako norabideak adierazten dituzte, eta neuronetan metileno urdinari buruzko literaturan bi motetako ebidentzien adibideak daude. Artikulu honek benetan zer neurtu zen aztertzen du, saiakuntzaz saiakuntza.

Makroautofagia, hemen aztertutako forma, zelularen eskala handiko birziklatze-prozesua da. Fagoforo izeneko mintz-zaku bat proteina eta organulu hondatuen inguruan hazten da, autofagosoma bat osatuz ixten da, lisosoma batekin fusionatzen da, eta haren karga degradatu eta askatu egiten da berrerabiltzeko. Neuronek prozesu horren beharra dute, ez baitira zatitzen eta ezin baitituzte kaltetutako osagaiak zatiketaren bidez diluitu. Birziklatzea gelditzen denean, hondakinak pilatzen dira. Martxan dagoenean, zelulak eraikuntza-osagaiak berreskuratzen ditu estres-egoeran.

Hipokanpoko esperimentu batek erakutsi zuena

Indukzioari buruzko ikerketa nagusiak saguaren hipokanpoko HT22 zelulak erabili zituen, 24 orduz serumik gabe utzita estresatuak. Egoera horrek hazkuntza-faktoreak eta seinale trofikoak kentzen ditu, eta apoptosia zein autofagia abiarazten ditu. Ikertzaileek jakinarazi zuten metileno urdinak zelula-heriotza murriztu zuela dosiaren arabera, eta babes horrekin batera makroautofagiaren zantzuak agertu zirela.

Markatzaileen emaitzak zehatzak izan ziren. LC3B tindaketa difusoa nukleo inguruko puntuetan birbanatu zen metileno urdinaren 20 nM ingurutik aurrera, eta LC3-I eta LC3-II erantzunik indartsuena 1 μM inguruan agertu zen. LC3B-I zein LC3B-II dosiaren eta denboraren arabera igo ziren. Funtsezkoa da taldeak LC3 immunoblot estatiko batetik harago jo izana. 10 μM klorokina gehitu zuten, lisosomen bidezko ezabaketa blokeatzen duena, eta metileno urdinarekin tratatutako zeluletan LC3-II maila handiagoak eta p62 egonkortua aurkitu zituzten. Eredu horrek lisosomen mendeko eraldaketa eta degradazioa babesten ditu, pilaketa hutsa baino. Klorokinak efektu antiapoptotikoa partzialki lehengoratu zuela ere erakutsi zuten; horrek ereduko babesa autofagiaren eta lisosomen bidearekin lotzen du.

Seinaleztapenaren emaitza da gehienetan oker aipatzen den zatia. AMPK seinaleztapena, AMPK fosforilatuaren eta haren beheranzko itu den ACC fosforilatuaren bidez neurtua, 12 eta 24 ordutan igo zen dosiaren arabera. AMPK inhibitzaile den Compound C, azken 4 orduetan 20 μM-ko kontzentrazioan aplikatuta, ACC fosforilazioa eta LC3 aktibazioa murriztu zituen. Aldiz, mTOR fosforilatuak ez zuen inhibizio detektagarririk erakutsi. Beraz, estresatutako hipokanpoko zeluletan, aurkikuntza AMPKri lotutako indukzioa izan zen, itxuraz mTORrekiko independentea zen bide baten bidez. Eredu bera agertu zen sagu bizietan: metileno urdinaren tratamenduak makroautofagia-markatzaileak induzitu zituen kortexean eta hipokanpoan.

Indukzioak ez du esan nahi fluxua osatu denik

Hemen da garrantzitsuena kontzeptuen arteko bereizketa. Indukzioak esan nahi du prozesuaren hasierako makineriak autofagosoma gehiago sortzen dituela. Fluxuak esan nahi du kargak ibilbide osoa egiten duela: bahiketa, heltzea, lisosomarekin fusionatzea, degradazioa eta birziklatzea. LC3-IIren igoera orok indukzioa baino ez du adierazten, fluxu-proba batek ibilbidearen gainerakoa baieztatu arte.

Fluxu-proba estandarrak LC3-II neurtzen du lisosomen blokeo labur batekin eta halakorik gabe, esaterako A1 bafilomizina edo klorokina erabiliz. Tratamenduak benetan ekoizpena bizkortzen badu, suntsipena blokeatzeak LC3-II are gehiago igo beharko luke. Tandem mCherry-GFP-LC3 erreportari batek beste ikuspegi bat ematen du: egiturek horia igortzen dute lisosomarekin fusionatu aurretik, eta gorria soilik ingurune azidoak GFP seinalea itzali ondoren; beraz, puntu gorri huts gehiago egoteak autolisosoma azidoetarako aurrerapena babesten du. p62 proteinaren jaitsierak kargaren degradazioa berrets dezake, baina kontuan hartu behar da p62 transkripzioak berak estresari erantzuten diola, eta mRNA mailan egiaztatu behar dela.

Beheko egiaztapen-zerrendak literatura honetan erabilitako saiakuntza bakoitza zer neurtzen duen eta bere kabuz zer ezin duen frogatu azaltzen du. Irakurleek etorkizuneko edozein makroautofagia-baieztapen aztertzeko berrerabil dezakete, baita markatzaile horiek baliatzen dituzten barauari eta bizitza-luzerari buruzko argudioak aztertzeko ere.

Kontuan hartu taulak saihesten laguntzen duen formulazio-tranpa bat. ACC fosforilatua entzimatikoki inhibitutako forma da. Haren igoerak AMPKren seinalearen irteera erakusten du, ez ACCren aktibazioa.

«Makroautofagia inhibitzeak neurobabesa ezabatu zuen» esaldiak zehaztasun bera behar du. HT22 ereduan esan nahi du autofagiaren eta lisosomen bidea oztopatzeak metileno urdinak serum-gabezian ematen zuen biziraupen-abantaila kendu zuela. Horrek babesten du autofagia beharrezkoa dela edo ekarpena egiten duela hazkuntza-plaka horretan. Ez du ezartzen autofagia konposatuaren babes-mekanismo bakarra denik, ez du frogatzen klorokinak autofagiaren bidez soilik jarduten duenik, eta ATG5, ATG7 edo ULK1 genetikoki eraldatu beharko lirateke kausalitate-baieztapena sendotzeko.

Makineria berera iristeko bi bide

Mapa sinplifikatu batek laguntzen du. Energia-estresak AMPK handitzen du, AMPKk ULK1 konplexua aktibatzen du, eta autofagia hasten da. Hazkuntza-faktoreek eta mantenugaiek mTORC1 handitzen dute, mTORC1ek ULK1 inhibitzen du, eta autofagia desaktibatuta mantentzen da. ULK1en ondoren, Beclin-1 eta VPS34 konplexuak fagoforoaren nukleazioa abiarazten du, LC3-I lipidatu eta LC3-II bihurtzen da, autofagosoma ixten da, lisosomarekin fusionatzen da, eta karga degradatzen da, p62 ere degradatzen den bitartean.

Diagramak metileno urdinari buruzko aurkikuntza bakoitza mapa honetan kokatzen du: hipokanpoko emaitza AMPK adarraren ondoan, eta zelula aitzindarietako emaitza mTOR adarraren ondoan.

Ikuspegi horrek Xieren bigarren ikerketarekiko itxurazko desadostasuna argitzen du. Ugaltzen ari ziren arratoien zelula aitzindari neuraletan, beste esperimentu batek aurkitu zuen 5 μM metileno urdinak ugalketa inhibitu eta kieszientzia sustatu zuela: Ki67 positiboak ziren zelulak gutxitu ziren 1. eta 3. egunetan, baina neurona bihurtzeko bidean zeuden zelulen diferentziazioak bere horretan jarraitu zuen. Kasu horretan, mekanismoak mTOR seinaleztapenaren inhibizioaren bidez jardun zuen: mTOR totalaren eta mTOR fosforilatuaren murrizketa, p70S6K eta 4EBP1 adierazpen txikiagoarekin batera, eta E1, B1, D1 eta D2 ziklinen beheranzko erregulazioa. Fenotipo nagusia zelula aitzindarien kieszientzia izan zen, eta egileek seneszentziaren atzerapenarekin lotu zuten, ez estresatutako hipokanpoko zelulak salbatzearekin.

Ez dago kontraesanik bi artikuluen artean. AMPK eta mTOR testuinguruarekiko sentikorrak diren integratzaileak dira, ez etengailu finkoak. Neuronaren antzeko zelula estresatu batek AMPK aktiba dezake mTOR inhibizio neurgarririk gabe; mitogenoek bultzatutako zelula aitzindari batek, berriz, konposatu berari erantzun diezaioke mTORren mendeko hazkuntza-makineria motelduta. Zelula motak, estresaren testuinguruak, kontzentrazioak eta neurketa-uneak erabakitzen dute zein adar nagusitzen den. Horregatik, metileno urdinak mitokondrioen energian eta erredox-prozesuetan dituen efektuak ere ikuspegi berean kokatu behar dira: neurobabesaren mekanismoei buruzko berrikuspen batek azaltzen duenez, konposatuak elektroi-eramaile alternatibo gisa jarduten du, seinaleztapen antioxidatzailea eta antiapoptotikoa aktibatzen ditu, MAO eta NOS inhibitzen ditu, eta mitokondrioen berritzearekin lotzen da biogenesiaren eta autofagiaren bidez. Autofagia profil pleiotropiko baten adar bat da, ez azalpen osoa.

Esperimentuek erakusten ez dutena

Serum-gabeziak estres trofikoa eta metabolikoa modelatzen ditu hazkuntza-plaka batean. Ez du organismo osoaren baraua modelatzen: glukosak, aminoazidoek eta gatzek oinarrizko hazkuntza-ingurunean jarraitzen dute, eta ez dago elikatze-portaerarik. Hazkuntza-inguruneko 20 nM eta 5 μM arteko kontzentrazioak ezin dira kalkulu aritmetikoen bidez gizakientzako dosi bihurtu, xurgapena, proteinekiko lotura, erredox-egoera, metabolismoa, ehunetako metaketa eta esposizio-denbora desberdinak direlako.

Ez da gizakietan saiakuntzarik diseinatu metileno urdinak pazienteengan fluxu autofagikoa induzitzen duela frogatzeko. Ebidentzia mekanistikoa zeluletako, ex vivo eta animalietako lanetara mugatzen da, eta berrikuspenek ebidentzia translazionala aurretiazkotzat deskribatzen dute oraindik. Beraz, ikerketa horiek ez dute erakusten metileno urdinak baraua erreproduzitzen duenik, autofagiaren bidez gizakien bizitza luzatzen duenik edo giza garunean fluxu autofagikoa osatzen duenik. Baraua imitatzen duela eta bizitza luzatzen duela dioten baieztapenek beren ebidentzia klinikoa behar dute, eta beste indikazio batzuetarako gizakietan egindako metileno urdinaren saiakuntzak ez dira autofagia-saiakuntza bihurtzen lotura hutsagatik. Mantenugai-estresaren eta bizitza-luzeraren ereduei buruzko ikerketak muga hori kontuan hartuta irakurri behar dira.

Irakurtzen duzun hurrengo artikuluan, aplikatu egiaztapen-zerrenda ordenan. Lehenik, galdetu zein adar aldatu zen: AMPK, mTOR edo bat ere ez. Ondoren, galdetu LC3 emaitzarekin batera fluxu-proba bat egin zen ala emaitza bakarrik dagoen. Gero, egiaztatu bidea blokeatzeak onura ezabatu zuen ala ez, eta zer metodoren bidez. Hiru galderei erantzuten dien ikerketa batek baieztapen mekanistiko sendoa egiteko oinarria du. Lehenengoari soilik erantzuten dionak baimen-seinale bat erakutsi du, eta ibilbidearen gainerakoa mapatu gabe dago oraindik.