Metileno-urdin berria eta erretikulozitoen tindaketa: beste tindagai bat eta zelula biziekin erabiltzeko metodo bat

Ikasle batek erretikulozitoen zenbaketa prestatzen du, metileno-urdina eskatzen du, odolarekin nahasten du eta ia ez du ezer ikusten. Ikaskide batek metileno-urdin berria etiketa duen botila bat erabiltzen du, eta harizpi urdin garbiak lortzen ditu globulu gorrietako batzuen barruan. Lehen ikasleak uste du bigarren botilakoa freskoagoa edo kontzentratuagoa dela. Ez da ez bata ez bestea. Beste molekula bat dauka.

Hori da arlo honetako nahaste gehienen oinarrian dagoen akats kontzeptuala. Izenak iradokitzen du metileno-urdin berria metileno-urdinaren sorta hobetu bat dela. Kimikak, ordea, bestelakoa dio. Metileno-urdin berria N fenotiazina-tindagai bereizi bat da, bere Colour Index zenbakia, ordezkapen-eredua eta hematologian eginkizun estandarizatua dituena. Bereizketa hori argi dagoenean, metodoaren gainerakoa ere erraz ulertzen da: zergatik egon behar duten zelulek bizirik tindatzean, zer hartzen den erretikulozitotzat, zer leku duten Heinz gorputzek eta noiz sartzen den jokoan kresilo-urdin distiratsua.

Erantzun laburra

Metileno-urdin berria N, hematologiako erreaktiboa, oro har Basic Blue 24 gisa identifikatzen da metileno-urdin berriaren PubChem erregistroan: C.I. 52030, CAS 1934-16-3, C18H22ClN3S formula. Metileno-urdin arrunta metiltioninio kloruroa da, Basic Blue 9, bere PubChem erregistroan: C.I. 52015, CAS 61-73-4, C16H18ClN3S formula. Egiturari dagokionez, metileno-urdin berriak bi metil talde ditu eraztunean eta etilamino albo-kateak, metileno-urdinak dimetilamino taldeak dituen lekuetan. Alde horrek tindaketa-portaera aldatzen du. Hematologiako testuek metileno-urdin arrunta erretikulozitoentzako tindagai nahiko eskastzat jotzen dute, eta metileno-urdin berriak tindaketa biziagoa eta uniformeagoa ematen duela azaltzen dute; alderaketa hori ScienceDirect-en metileno-urdin berriari buruzko atalean laburbiltzen da.

Bai, metileno-urdin berria tindagai suprabitala da. Tindaketa suprabitalak zelula biziak tindatzea esan nahi du, gorputzetik atera ondoren eta finkatu aurretik, NCBIren tindaketa suprabitalaren printzipioei buruzko berrikuspenean definitzen den bezala. Bai metileno-urdin berria bai kresilo-urdin distiratsua kategoria horretakoak dira, eta erretikulozitoei buruzko CLSI arauak metileno-urdin berria berariaz jasotzen du tindagai suprabital gisa. Ikasleek batzuetan finkatutako hedakinen Romanowsky tindaketarekin lotzen dute metodo hau. Eredu mental horrek ez du hemen balio. Lehenik finkatuz gero, metodoak funtzionatzeari uzten dio.

Antzeko tindagai-izenak aztertzen ari diren irakurleentzat, metil-urdinaren eta metileno-urdinaren arteko alderaketak bestelako nahaste handiago bat argitzen du: triarilmetano-tindagai anioniko baten eta fenotiazina-familia katioikoaren artekoa. Laborategiko tindaketaren ikuspegi orokorrak lan suprabitala finkatutako hedakinen metodoekin batera kokatzen du, eta odol-zelulen morfologiaren gidak erakusten du erretikulozitoen ebaluazioak zer leku duen zenbaketa diferentzial zabalagoan.

Katalogoei buruzko ohar bat: metileno-urdin berriaren zink klorurozko gatz bikoitzeko beste forma bat ere badago, CAS 6586-05-6 zenbakiarekin. Beraz, metodoen atalean gatz-forma eta hornitzailea adierazi behar dira, ez izen arrunta soilik.

Zer egiten duen benetan tindaketa suprabitalak

Erretikulozitoa globulu gorri gazte bat da, nukleoa galdu duena baina oraindik RNA erribosomalaren hondarrak dituena. Tindatu gabeko prestakin heze batean, RNA hori ikusezina da. Tindagai suprabitala zelula bizian sartzen da, eta RNA hori pikor eta harizpi urdinetan hauspeatzen edo agregatzen du; hori da olio-murgilketarekin ikusten den material erretikulofilamentutsua. Beraz, sarea tindaketaren emaitza da, ez koloreztatzeko zain dagoen aurrez eratutako eskeleto bat. Horregatik, protokoloaren aldagaiak —tindagaiaren kontzentrazioa, tanpoia, odolaren eta tindagaiaren arteko proportzioa, tenperatura eta denbora— tindagaiaren izena bezain garrantzitsuak dira.

Ondorio praktikoa eragiketen ordena zorrotza da: lehenik, odol antikoagulatua tindagaiarekin nahastu; inkubatu; eta, ondoren, hedakinak egin eta finkatu gabe eta kontratindaketa gabe aztertu. Tindatu aurretik finkatzeak, edo harizpi ahulak ezkutatzen dituen kontratindaketa batek, zenbaketarako beharrezkoa den informazioa suntsitzen du.

Erretikulozitoetarako lan-protokolo bat metileno-urdin berriarekin

Ez dago formulazio unibertsal bakar bat; beraz, erabilitakoa adierazi behar da. Dokumentatutako hiru aldaerak erakusten dute aukeren tartea.

Brecher motako prozedura klasikoak gutxi gorabehera ehuneko 0.5eko metileno-urdin berria erabiltzen du, potasio oxalatoarekin. Ondo nahastutako EDTA odolarekin bolumen berdinetan nahasten da, eta giro-tenperaturan inkubatzen da 10 eta 15 minutu inguru. Berriro astiro nahastu ondoren, ziri-formako hedakin meheak prestatzen dira, airean lehortzen dira eta finkatu gabe aztertzen dira, olio-murgilketako 100x objektiboarekin. NCBIren erretikulozitoak zenbatzeko prozedurak lan-fluxu hori eta harekin erabiltzen den zenbaketa-markoa deskribatzen ditu.

Dacie eta Lewis aldaerak ehuneko 1.0ko metileno-urdin berria erabiltzen du zitrato-gatz-disoluzioan; odolaren 2 eta 4 bolumen arteko kantitatearekin nahasten da, eta 37 C-tan mantentzen da 15 eta 20 minutuz, hedakinak egin aurretik. CLSI H44 prozeduraren harmonizazioa ezartzeko berriki egindako lan batek ehuneko 0.1eko disoluzio diluituagoa erabili zuen, fosfatoz tanponatutako gatz-disoluzioan, pH 7.4rekin, 20 C-tan 10 minutuz inkubatuta eta finkatu gabe, 2026ko NMB harmonizazio-azterketan jasotzen denez.

Zenbaketa-arauak berdinak dira aldaera guztietan. Zelula bat erretikulozitotzat zenbatu gutxienez urdinez tindatutako bi pikor bereizi edo harizpi-segmentu baditu; horrela, tindagai-gordailu isolatuak baztertzen dira. Ohiko lanean, gutxienez 1,000 globulu gorri zenbatu, eta erretikulozitoak ehuneko gisa adierazi. Ehuneko txikietan, estatistikak zelula gehiago eskatzen ditu. CLSI H44 metodologiaren berrikuspen batek dio erretikulozitoak ehuneko 1 ingurukoak direnean 4,400 zelula inguru behar direla zenbaketaren aldakortasuna ehuneko 5era murrizteko, De Gruyter-eko CLSI H44 berrikuspenean. Miller disko okular batek zenbaketa handiak egingarri bihurtzen ditu. Tindagaia iragazi edo prestatu berria erabili, hauspeakinek inklusio pikortsuak imitatzen baitituzte.

Heinz gorputzak prestakin berean

Hedakin suprabital berak Heinz gorputzak ere erakuts ditzake; horiek hemoglobina oxidatu eta desnaturalizatuaren agregatuak dira, ez RNA hondarrak. Metileno-urdin berriarekin egindako prestakinetan gorputz biribil gisa agertzen dira, sarritan bakarka eta mintzetik gertu, material erretikulofilamentutsua baino urdin argiagoz tindatuta. Finkatzean eta kontratindaketan ez dira ondo kontserbatzen; beraz, finkatu gabeko hedakina aztertu. Berriki egindako protokolo batean EDTA odolaren 20 mikrolitro eta ehuneko 1eko metileno-urdin berriaren 20 mikrolitro erabili ziren, 15 minutuko inkubazioarekin, eta Heinz gorputzak zituzten zelulak kuantifikatu ziren 250 eritrozitoren artean, prozedura hori jasotzen duen PMC azterketan.

Bi bereizketak interpretazio okerrak saihesten dituzte. Lehenik, metil-bioletak eta kristal-bioletak metileno-urdin berriak baino biziago tindatzen dituzte Heinz gorputzak, ScienceDirect-en Heinz gorputzei buruzko atalean adierazten denez. Metileno-urdin berria aukera praktikoa da erretikulozitoak eta Heinz gorputzak batera ebaluatzen direnean, baina ez da Heinz gorputzak berariaz tindatzeko tindagairik indartsuena. Bigarrenik, alfa-talasemia ezaugarrian HbH inklusioek puntu fin ugari sortzen dituzte zelula osoan tindaketa suprabitalaren ondoren; Heinz gorputz klasikoak, aldiz, gutxiago eta handiagoak dira, eta sarritan mintzari lotuta daude. Tindagai-gordailua da hirugarren imitazioa: zelulen plano fokaletik kanpo dago, eta eremu batetik bestera aldatzen da.

Kresilo-urdin distiratsua eta metileno-urdin berria

Bi tindagaiak erretikulozitoetarako tindagai suprabitalak dira, baina estandarizazioak haietako bat hobesten du. CLSI H44-A2 erretikulozito-metodoa, International Council for Standardization in Haematology erakundearekin batera garatua eta CLSI H44 arauaren orrian zerrendatua, EDTA odola metileno-urdin berriarekin tindatzea ezartzen du eskuzko konparazio-metodo gisa. Hematologiaren irakaskuntza klasikoa bat dator itxurari dagokionez: metileno-urdin berriak harizpien tindaketa biziagoa eta uniformeagoa ematen du; kresilo-urdin distiratsuak, aldiz, aldakortasun handiagoa du sorta eta laginen artean.

Maila horri ñabardura bat gehitu behar zaio. ICSHren analizatzaileak ebaluatzeko gidalerroak metileno-urdin berriarekin egindako eskuzko mikroskopia onartzen du erreferentziazko konparazio-metodo gisa, baina subjektiboa eta nahiko zehaztasun txikikoa dela dio, eta fluxu-zitometriako erreferentzia-prozedurak hobesten ditu eskuragarri daudenean. 2022an 100 laginekin egindako alderaketa batek, erabilitako analizatzailearekiko, alborapen txikiagoa aurkitu zuen kresilo-urdin distiratsuarekin metileno-urdin berriarekin baino, tindaketa-metodoen PMC alderaketan jasotzen denez. Ikasleentzako laburpen arrazoitua hau da: metileno-urdin berria erabili eskuzko konparatzaile estandarizatu gisa, tokiko kresilo-urdin distiratsuaren edozein metodo harekin edo automatizazioarekin alderatuz egiaztatu, eta, batean zein bestean, eskuzko mikroskopiak sakabanatze handiagoa izango duela aurreikusi. Estandarizazioari buruzko literatura zaharragoak Azure B araztua ere proposatu zuen kimikoki garbiagoa zen alternatiba gisa, tindagai komertzialen sortak aldakorrak zirelako, Marshall-en Azure B-ri buruzko azterketan. Horrek azaltzen du zergatik agertzen den oraindik erreaktiboaren kalitatea metodoei buruzko eztabaidetan.

Ohiko akatsak saihestea

Lau akatsek azaltzen dituzte huts egindako prestakin gehienak. Metileno-urdin berria N eskatu beharrean metileno-urdin arrunta eskatzeak tindaketa ahula eragiten du kimikagatik, ez teknikagatik. Irakurri aurretik finkatzeak edo kontratindatzeak seinale suprabitala ezabatzen du. Tindagaiaren hauspeakina pikor gisa zenbatzeak emaitza puzten du; bi pikorren arauak eta tindagai iragaziak hori saihesten dute. Erretikulozitoen ehunekoak txikiak direnean zelula gutxiegi zenbatzeak zehatza dirudien zenbaki bat ematen du, baina konfiantza-muga zabalekin. Akats guztiek ezaugarri bera dute: mikroskopistak mikroskopioari egozten dio erreaktiboaren urratsak erabakitakoa.