Masail-zelulak metileno-urdinez tindatzea: zer behatu

Ikasle batek masail-zelulen esekidura-tanta bat jartzen du portaobjektu batean, mikroskopiotik begiratzen du, eta ia ez du ezer ikusten. Mamu zurbil batzuk eremu argitsu batean zehar mugitzen dira. Fokua doitzen du, gero argia handitzen du, eta azkenean portaobjektua hutsik dagoela ondorioztatzen du. Portaobjektua ez dago hutsik. Zelulak hor daude. Ia gardenak dira, eta gardentasuna da, hain zuzen, tindaketa honek konpondu nahi duen arazoa.

Itxaropenaren eta irudiaren arteko desadostasun hori aipatzea komeni da protokoloari ekin aurretik. Hasiberriek espero dute mikroskopioak xehetasunak erakustea, kamera baten zoomak urruneko kartel bat erakusten duen bezala. Eremu argiko mikroskopio batek zerbait mugatuagoa egiten du: argiaren xurgapeneko aldeak erakusten ditu. Tindatu gabeko masail-zelula batek ia ez du argirik xurgatzen, eta, beraz, ia ez du alderik sortzen. Metileno-urdinak sortzen du alde hori. Zelularen barruan lotzen da, modu ez-uniformean, eta egitura kontraste bihurtzen du. Ikasleek kontzeptu hori ulertzen dutenean, ondorengo urrats bakoitza ondorio gisa ulertzen da, ez errezeta gisa.

Eskolako laborategian tindaketa sinpleek kontrastea nola gehitzen duten jakitea lagungarria da hemen, eta tindatu aurretik eremu argiko mikroskopioa prestatzeko moduari buruzko errepasoak huts egiten duten prestakinen erdiak saihesten ditu. Kolorearen atzean dagoen kimika mikroskopian metileno-urdinari buruzko sarrera batean azaltzen da; bertan, koloratzaile jakin hori laborategiko mahaian zergatik agertzen den behin eta berriro aztertzen da.

Ikasgelako protokoloa

Beheko muntaketa hezea aukera lehenetsi errazena da eskola arruntetarako. Ez du surik behar, ezta finkapen-urratsik ere. Unibertsitateko eskuliburu batzuetan erabiltzen den finkatutako frotisaren aldaerak airean lehortzea eta bero bidezko finkapen laburra gehitzen ditu, Biology LibreTexts bidez argitaratutako North Central Texas College-ren masail-frotisaren jardueran bezala; baina bero bidezko finkapena mikrobiologiako ohitura bat da, ez zelula epitelialak ikusteko baldintza bat.

Behar duzuna: portaobjektu eta estalki garbiak, erabilera bakarreko torunda esterilak (hobetsiak) edo hortzetako zotz lau berriak, metileno-urdinaren ehuneko 0.5 eta 1 arteko ur-disoluzioa duen tanta-kontagailudun botila bat, ur destilatua edo desionizatua, paper xurgatzailea, eskularruak eta guztizko 100x eta 400x handipena duen mikroskopio konposatu bat.

1. Garbitu ahoa ur hutsez. Horrela, gero biziki tindatzen diren eta zelulei arreta kentzen dieten janari-partikulak kentzen dira.
2. Ikasle bakoitzak bere masailaren lagina bakarrik hartzen du. Igurtzi masailaren barrualdea leunki torunda esteril berri batekin. Sakatu, ez arraspatu. Gelditu ondoezik edo odoljariorik agertu baino askoz lehenago.
3. Birarazi torunda portaobjektu garbi baten erdialdean zehar, geruza mehe bat utziz. Geruza mehea da prestakina ondo ikusteko faktorerik garrantzitsuena. Metaketa zuri lodi bat masa urdin bereizezin bihurtuko da tindatzean.
4. Gehitu metileno-urdin tanta bat frotisaren gainean. Utzi 1 eta 3 minutu artean. Minutu bat nahikoa da unibertsitateko protokolo askotan; NCERT erakundearen IX. mailako zientzia-laborategiko eskuliburuak 3 minutu inguru erabiltzen ditu aldi baterako muntaketa baterako. Denbora gehiago ez da hobea, eta gehiegi tindatzea da denborarekin lotutako akatsik ohikoena.
5. Garbitu leunki ur destilatuarekin, edo xurgatu gehiegizko koloratzailea paper xurgatzailearekin, tokiko protokoloari jarraituz. Atzealdea urdin zurbil bihurtu behar da, ez itsas urdin ilun.
6. Jaitsi estalkia angelu batean, ertz batek lehenik ukitu dezan, eta gero utzi poliki jaisten. Horrela ez da aire-burbuilarik sartzen.
7. Hasi handipen txikiarekin zelulak aurkitzeko, egiaztatu fokua eta zentratzea, eta gero pasatu 100x handipenera eta, azkenik, 400x handipenera. 400x handipenean, erabili fokuaren doikuntza fina soilik.

Koloratzailearen kontzentrazioak zehaztasunezko esaldi bat merezi du. Eskolako protokolo gehienek ehuneko 1 inguruko metileno-urdinaren ur-disoluzioa erabiltzen dute. Disoluzio kontzentratuago batek edo esposizio luzeak azkarrago iluntzen du atzealdea nukleoa baino, eta horrek ariketaren oinarri den kontrastea alderantzikatzen du.

Masail-materiala modu seguruan manipulatzea

Masail-laginek listua eta ahoko ohiko mikroorganismoak dituzte; beraz, tratatu frotis fresko oro material potentzialki infekzioso gisa, nahiz eta emaileak ikaskide osasuntsuak izan. American Society for Microbiology erakundearen irakaskuntza-laborategietarako biosegurtasun-gidalerroek printzipio orokorrak ezartzen dituzte: saioaren aurretik arriskua ebaluatzea, eskularruak janztea, zipriztinak gerta daitezkeenean begiak babestea, ondoren eskuak garbitzea, laborategiko mahaiak desinfektatzea eta kutsatutako erabilera bakarreko materialak hondakin biologikoetarako onartutako bidetik botatzea.

Ikasgelako lau arauk arrisku gehiena estaltzen dute. Emaile bakarra torunda eta portaobjektu bakoitzeko; ez dira inoiz partekatzen. Norberaren lagina bakarrik hartu, inoiz ez albokoarena. Erabilera bakarreko torundak eta hortzetako zotzak zuzenean izendatutako hondakin-ontzira doaz, ez dira inoiz berriro laborategiko mahaian uzten. Metileno-urdinak berak azala eta arropa tindatzen ditu eta begiak narritatzen ditu; beraz, eskularruak eta koloratzaileekin erabiltzen diren ohiko higiene-neurriak behar dira. Ez luzatu ariketa hau frotisetik hartutako ezer kultibatzera, eta ez inprobisatu giza material freskoaren bero bidezko finkapenik eskolako segurtasun-prozeduratik kanpo.

Zer behatu, eta zergatik duen itxura hori

100x handipenean, bilatu zelula zabal eta lauak, urdin zurbilak, obalo irregularren edo poligonoen itxurako ingeradak dituztenak. Banaka edo elkarren gainean laxoki jarritako geruzetan daude. Zelula bakoitzak normalean orban urdin ilunago bat du. Orban hori nukleoa da. Erreparatu antolamenduari ere: zelula epitelial ezkatatsuak lauza meheak dira, ez esferak; horregatik, haien ertzek esmalte pitzatuaren itxura dute, ez puxika biribilena.

400x handipenean, hiru ezaugarri argi bereizten dira. Zelularen muga zelula inguratzen duen lerro mehe eta ilunago gisa agertzen da. Zitoplasmak barrualdea urdin argi eta uniformez betetzen du. Nukleoa ilunagoa eta trinkoagoa da, sarritan obalatua, normalean erdialdetik gertu baina ez beti. Eskatu ikasleei hirurak erregistratzeko, baita forma eta handipena ere, lan-orriak horixe eskatzen baitu.

Zehaztasunari buruzko puntu bat garrantzitsua da hemen, eta lan-orri askok gaizki azaltzen dute. Ikusten den muga mintz plasmatikoaren eremuari dagokio, baina mintza bera, 7 eta 10 nanometro inguruko lodiera duen lipido-geruza bikoitza, eskolako mikroskopio batek bereiz dezakeena baino askoz txikiagoa da. Ikasleek ikusten dutena zelularen ertz optikoa eta bertan metatutako koloratzailea da. Zuhurtzia bera aplikatu behar zaie organuluei. Mitokondrioak, erretikulu endoplasmatikoa, Golgi aparatua eta erribosomak ez dira prestakin honetan agertzen. Argi-mikroskopio arrunt batek 0.2 mikrometro ingururainoko bereizmena du baldintza onetan, NCBIren mikroskopia-tresnei buruzko zelula-biologiaren azalpenak dioen bezala, eta ultraegitura gehiena muga horren azpitik edo inguruan dago. Handipen huts handiagoak irudia handitzen du, xehetasunik gehitu gabe.

Zergatik tindatzen da nukleoa ilunen? Metileno-urdina koloratzaile kationikoa da, disoluzioan karga positiboa duena, eta zelulako karga negatibodun materialarekin elkartzen da, batez ere azido nukleikoekin. Kromatinak DNA nukleoan kontzentratzen du; beraz, nukleoak metatzen du koloratzaile gehien. Zitoplasmak RNA eta kargadun beste molekula batzuk ditu; hortaz, hori ere tindatzen da, baina modu lausoagoan eta argiagoan. Funtsezko ñabardura: metileno-urdina ez da DNArako koloratzaile espezifikoa. Irudi nuklearretan metileno-urdinaren banaketari buruzko lanak katioia azido nukleiko ugariko eremuekin elkartzen dela deskribatzen du, eta zelula-prestakinetan metileno-urdinaren loturari buruzko lan kuantitatibo zaharrago batek aurkitu zuen lotutako koloratzaile gehiena azido nukleikoekin elkartuta zegoela. Nukleo iluna eta zitoplasma argia, beraz, kontraste-eredu bat dira, ez saiakuntza molekular bat.

Ikasleek egingo dituzten akatsak, eta nola interpretatu

Huts egiten duten ia prestakin guztiak bost ereduetako batean sartzen dira. Irakatsi ikasleei prestakinaren arazoa identifikatzen, itsu-itsuan berriro egin beharrean.

Gehiegi tindatzeak zelulak eta atzealdea berdin iluntzen ditu, eta nukleoa eremuan galtzen da. Konpondu tindaketa-denbora laburragoarekin edo garbiketa sakonagoarekin. Gutxiegi tindatzeak argia handitzean desagertzen diren mamuak uzten ditu; luzatu denbora hogeita hamar segundoko tarteetan. Frotis lodiek masa trinko gainjarriak sortzen dituzte, eta ezin da inolako ingeradarik jarraitu; zuzenketa mekanikoa da: hurrengoan geruza meheagoa zabaldu, garbiketak ez baitu zelula-pila bat konpontzen. Aire-burbuilak ertz ilun eta nabarmeneko zirkulu perfektu gisa agertzen dira, eta egiturekin nahasten dituzten hasiberrien arreta desbideratzen dute; jarri berriro estalkia poliki, angelu batean. Zelulen gainean edo inguruan sakabanatutako puntu ilun txikiak ahoko ohiko bakterioak izaten dira, eskolako protokoloek, hala nola Ingrid Science-ren masail-zelulen prozedurak, adierazten duten bezala. Ahoan bizidunak daudela baieztatzen dute, eta hori gogoangarria izan daiteke ikasleentzat, baina ariketa honetan ezin da haien espeziea identifikatu eta ez dira zelularen atal gisa marraztu behar. Janari-hondarrak eta muki-hariak modu irregularrean eta biziki tindatzen dira; aurretiko aho-garbiketaren helburua horiek murriztea da.

Ariketa honek egin ezin duena

Hau hezkuntzarako behaketa bat da, ez proba diagnostiko bat. Ikasgelako tindaketa batean zelulen itxurak ez du infekziorik, minbizirik edo bestelako gaixotasunik diagnostikatzeko balio, eta artikulua ez da kontrakoa iradokiko balu bezala irakurri behar. Prestakinak forma, muga, zitoplasma eta nukleoa erakusten ditu bi handipenetan. Ez du mintzaren ultraegitura, organuluen xehetasunik edo identitate molekularrik erakusten. Muga esplizituki adierazteak zientzia zein ikasleak babesten ditu: emaitza ona behar bezala etiketatutako marrazkia da, handipena eta tindaketa erregistratuta dituena, ez osasunari buruzko ondorio bat.

Ikasleentzako lan-orria eta mikrografia etiketatuak

Orrialde honetako proiektuaren bi baliabideak goiko mikrografia etiketatua eta beheko lan-orria dira. Inprimatu lan-orri bana ikasle bakoitzarentzat, edo proiektatu eta eskatu ikasleei laukitxoak koadernoetan kopiatzeko.

Nola erabili 45 minutuko saio batean: hamar minutu segurtasun-azalpenetarako eta laginak hartzeko, hamar minutu tindatzeko eta muntatzeko, hamabost minutu bi handipenetan behatzeko eta zirriborroak egiteko, eta hamar minutu egiaztapen-zerrendarako eta mikrografia etiketatuarekin alderatzeko. Egiaztapen-zerrendako elementuak nahita dira mekanikoak. Frotis mehea, tindaketa-denbora zuzena, nukleoa zitoplasma baino ilunagoa, handipena erregistratuta. Laurak markatzeko gai den ikasleak ikasgaiaren helburu den kontzeptua ulertu du: mikroskopioek aldeak erakusten dituzte, eta tindaketek erakustea merezi duten aldeak sortzen dituzte.