Loefflerren metileno urdin alkalinoa eta metileno urdin polikromoa: tindaketen azalpena

Tindaketa-mahai batean hiru botila egon daitezke elkarren ondoan, bakoitza metileno urdinaren aldaera baten izenarekin etiketatuta. Batean, metileno urdinaren % 1eko ur-disoluzioa jartzen du. Beste batean, Loefflerren metileno urdin alkalinoa. Hirugarrenean, metileno urdin polikromoa. Lanpetuta dagoen langileak hurbilen dagoena hartzen du. Ondoren, frotisa ahulegi tindatzen da, edo urdin uniformegia geratzen da, edo ustekabeko more-ñabardurak hartzen ditu, eta emaitzaren errua laginari egozten zaio.

Formulazio-arazoa da hori, ez laginaren arazoa. Hiru disoluzioek elkarren antzeko koloratzaileak dituzte, baina tindaketa-kontzeptu desberdinak dituzte oinarri. Bata koloratzaile kationiko arrunta da, pH ia neutroan. Bestea koloratzaile bera da, alkaliak indartua. Hirugarrena ez da jada koloratzaile bakarra, nahita oxidatutako nahastea baizik. Okerrekoa erabiliz gero, tindaketa-printzipioa aldatzen da zure eskuetan.

Erantzun laburra

Metileno urdinaren ur-disoluzio arrunta da abiapuntua: % 1 inguru koloratzaile uretan, bakterioen morfologiarako eta mikroskopia orokorrerako tindatzaile kationiko sinplea. Loefflerren metileno urdin alkalinoa prestatzeko, alkali diluituaren kantitate txiki eta neurtu bat gehitzen zaio uretan diluitutako disoluzio ama alkoholiko bati; horrek pH-a igotzen du eta koloratzaile kationikoa bakterioen egitura azidoetara sendoago lotzea eragiten du. Metileno urdin polikromoa alkalitan oxidazio bidez nahita heldutako metileno urdina da; beraz, botilak homologo desmetilatuen nahastea (azure A, azure B, azure C), tionina eta metileno bioleta ditu, hondar-metileno urdinarekin batera, eta nahaste horrek egitura desberdinak kolore desberdinez tindatzen ditu.

Esaldi bakarra gogoratu behar baduzu: alkalinizazioak tindaketaren intentsitatea aldatzen du; polikromatzeak, berriz, tindaketaren koloreak.

Metileno urdinaren ur-disoluzio arrunta: erreferentzia-puntua

Formulaziorik sinpleena uretan disolbatutako metileno urdina da, normalean 1% w/v-ko kontzentrazioan, alkalirik eta oxidaziorik gabe. Espezie koloreduna metiltioninio katioia da, kloruro kontraioiarekin; fenotiazinaren familiako koloratzaile txiki eta laua da, PubChemeko metileno urdinaren fitxan metiltioninio kloruro gisa deskribatua. Katioia denez, azido nukleikoen fosfato-eskeletoei eta bakterioen zelula-paretetako talde azidoei lotzen zaie, eta zelulak urdinez tindatzen ditu hondo argi baten gainean.

Haren abantaila aurreikusgarritasuna da. Nukleoak eta bakterioak urdin agertzen dira. Kontrastea apala da. Gutxi nabarmentzen diren organismoak ahul tinda daitezke; hain zuzen ere, muga hori gainditu nahi izan zuen Loefflerrek. Disoluzio hau barne hartzen duen bakterio-tindaketa sinpleen familia zabalagoari buruz jakiteko, kontsultatu bakterioen tindaketa sinpleari buruzko ikuspegi orokor bat. Hemen ere garrantzitsua da koloratzailearen identitatea zorrotz egiaztatzea: metil urdina erabat bestelako molekula bat da, metil urdinaren eta metileno urdinaren arteko alderaketak azaltzen duenez; beraz, katalogoan kolorearen izena soilik erabiliz bilatzeak koloratzaile mota okerra ekar dezake.

Loefflerren metileno urdin alkalinoa: koloratzaile bera, indartua

Loefflerren errezeta klasikoak metileno urdinaren disoluzio ama alkoholikoa eta uretan diluitutako alkalia konbinatzen ditu. Testuliburuetako bertsioek 0.3 g koloratzaile eskatzen dituzte 95% etanolaren 30 mL-tan, gehi 0.01% potasio hidroxidoaren ur-disoluzioaren 100 mL (edo, baliokide gisa, metileno urdinaren disoluzio alkoholiko asearen 30 mL, ur destilatuaren 100 mL eta 1% KOH-ren 1 mL). Horrela, gutxi gorabehera 0.3% koloratzaile duen lan-disoluzioa lortzen da, pH argi eta garbi alkalinoarekin. Bertsio komertzialek printzipio bera jarraitzen dute, eta Thermo Fisherren mikrobiologiako tindatzaileen katalogoak Loefflerren metileno urdin alkalinoa, aldaera polikromoa eta ur-disoluzioa katalogoko produktu bereizi gisa zerrendatzen ditu, bakoitza bere erabilera-helburuarekin.

Alkalia da gakoa. pH-a igotzeak laginaren karboxilo eta fosfato taldeak desprotonatzen ditu, eta karga negatiboko guneen dentsitatea handitzen du; bitartean, disoluzio ama alkoholikoak koloratzailea erabat disolbatuta mantentzen du, gune horietara forma monomerikoan irits dadin. Ondorioz, bakterioak ur-disoluzio neutroarekin baino azkarrago eta biziago tindatzen dira, ohiko frotis bakteriologikoetan ikusten diren urdin iluneko bazilo eta koko ezagunak emanez. Tindaketa-denbora minutu batetik hirura artekoa izaten da, eta ondoren urez garbitzen da.

Erabilera klasikoa Loefflerren serum-ingurunean hazitako Corynebacterium diphtheriae tindatzea da: bazilo meheak, sarritan mazo-itxurakoak, metatutako polifosfatoaren Babes-Ernst granulu metakromatikoak bizi tindatuta dituztenak. Ingurunearen eta tindatzailearen arteko lotura historikoa da, biak bakteriologo berari egozten baitzaizkio, eta granuluen kontrastea da abantaila diagnostikoa. Difteriari lotutako lanez gain, tindatzailea tindatzaile bakteriologiko orokor gisa erabiltzen da kultiboetako frotisetan, frotis klinikoetan Neisseriaren morfologia aztertzeko, eta Gram tindaketa beharrezkoa ez den baina ur-disoluzio arruntaren urdina ahulegia den kasuetan. Tindatzaile monokromoa da. Azidoa den guztia urdinaren ñabarduraren batez tindatzen da. Protokoloak koloreen bidezko bereizketa eskatzen duenean, alkaliak bakarrik ezin du hori eman.

Ohar praktiko bat: koloratzaile-disoluzio alkalinoak hondatu eta hauspeatu egiten dira biltegiratzearekin eta karbono dioxidoa xurgatzearekin. Laborategiek bolumen txikiak prestatzen dituzte, edo katalogoko disoluzioa erosi eta haren balio-bizitza errespetatzen dute, portaobjektu guztietan sedimentua uzten duen botila zahar bat luzaroan erabiltzen jarraitu beharrean.

Metileno urdin polikromoa: izen bat, hainbat koloratzaile

Metileno urdin polikromoa koloratzaile beretik abiatzen da, baina alkalitan oxidazio kontrolatua eragiten zaio; historikoki, heltzea edo polikromatzea deitu izan zaio prozesu horri. Zahartze alkalinoak, karbonatoarekin berotzeak edo dikromatoa bezalako agenteekin oxidatzeak metil taldeak kentzen dizkie dimetilamino ordezkatzaileei, urratsez urrats. Emaitza nahaste bat da: hondar-metileno urdina, azure B (metil talde bat galduta), azure A eta azure C (desmetilazio handiagoarekin), tionina (erabat desmetilatua) eta metileno bioletaren familiako oxidazioaren albo-produktuak. Osagai bakoitzak bere kolore-ñabardura eta ehunekiko afinitatea ditu; horregatik, nahasteak metakromatikoki tindatzen du: nukleoek, granuluek, muzinek eta kartilagoak tonu desberdinak hartzen dituzte, urdinetik gorri-morera.

Kimika hori bera dago odol-tindaketa ospetsuen oinarrian. Lehen ikertzaileek ikusi zuten metileno urdin alkalinizatuak malariaren parasitoaren nukleoak more-ñabardurez tindatzen zituela, baina haien ur-disoluzio helduak ezegonkorrak ziren eta egun gutxitan hauspeatzen ziren. Odol-tindaketa morea nola asmatu zen azaltzen duen berrikuspenak kontatzen du Malachowskik eta Romanowskyk efektu hori nola baliatu zuten bakoitzak bere aldetik 1891n, metanola nola sartu zen koloratzailearen hauspeakina egonkortzeko eta frotisak berorik gabe finkatzeko, eta Giemsak geroago nahastea nola estandarizatu zuen neurtutako azure B eta eosina erabiliz, glizerolarekin egonkortuta. Gaur egungo Giemsa motako tindatzaileak metileno urdin polikromoaren eta eosinaren konbinaziotik datoz zuzenean; konbinazio horrek sortzen du Romanowsky efektua. Eosinarekin konbinatzeari eta azure B osagaiari buruzko xehetasunetarako, ikusi Romanowsky motako tindatzaileak eta azure B-ren eta eosinaren arteko elkarrekintza.

Nahastea denez, metileno urdin polikromoa da berez hiruretan gutxien estandarizatuta dagoena. Haren kolore-ñabarduren oreka zehatza oxidazio-bidearen eta oxidazio-mailaren araberakoa da; horregatik, histologiako hornitzaileek produktu bereizi gisa saltzen dute, bere errendimendu-proba propioekin, eta ez Loefflerren tindatzaile zahartu gisa. Ohiko erabileren artean daude mastozitoen granuluak, muzinak eta kartilagoa metakromatikoki agerian jartzea, zelula plasmatikoen xehetasunak erakustea, eta ehun-ebakietan Helicobacter pylori tindatzea Goodpasture motako metodo polikromoen bidez. Aukera egokia da koloreen bidez bereiztea denean helburua, eta aukera okerra protokoloak bakterioen silueta monokromo garbia espero duenean.

Formulazioen eta helburuen alderaketa

Irakurri taula erabakiak hartzeko prozedura gisa. Lagina ahulegi tindatzen bada, aldatu pH-aren ikuspegia eta hartu Loefflerren tindatzailea. Dena tindatzen bada baina ezer ez bada bereizten, aldatu koloratzailearen ikuspegia eta hartu polikromoa. Loefflerren tindatzailearekin prestatutako frotis batek granuluak ederki erakusten baditu baina arduradunak nukleoek eta zitoplasmak zergatik urdin bera duten galdetzen badu, erantzuna da tindatzaile monokromo alkalino batek ezin duela bereizketa hori egin. Galdera hori familia polikromoari eta haren odol-tindaketarako deribatuei dagokie.

Ohiko nahasketak saihestea

Bi akatsek eragiten dute nahaste gehiena. Lehenengoa da Loefflerren tindatzailea eta metileno urdin arrunta trukagarritzat hartzea, botilan biek urdin itxura dutelako. pH eta intentsitate desberdinak dituzte, eta Loefflerrena zehaztuta dagoen lekuan koloratzaile neutroa erabiltzeak protokoloaren oinarri den granulu-kontrastea galtzea dakar. Bigarrena da edozein urdin alkalino zahar edo ustekabean zahartu polikromotzat hartzea. Kontrolik gabeko zahartzeak nahaste ezezaguna sortzen du, indar ezezagunekoa; benetako disoluzio polikromoak, berriz, definitutako oxidazio-bideen bidez prestatzen dira eta, odol-tindatzaileen leinuan, neurtutako eosinarekin konbinatzen dira. Historia argigarria da hemen: 1890eko hamarkadako ur-disoluzio heldu ezegonkorren ordez metanolez egonkortutako formulazioak erabiltzen hasi ziren, hain zuzen ere kontrolik gabeko nahasteak ezin zirelako modu erreproduzigarrian prestatu. Ikasgai hori gogoratzea merezi du, adin zalantzazkoko botila batekin diagnostikorako portaobjektu bat tindatu aurretik.

Izendapenak zorrotz egiaztatzeak ixten du zirkulua. Egiaztatu etiketan katalogoko produktua (ur-disoluzioa, Loefflerrena edo polikromoa), koloratzaile-edukia eta aurreikusitako erabilera, koloretik ondorioztatu beharrean. Hiru formulazioek kromoforo-aitzindari bera dute. Ez dute helburu bera.