Metüleensinisega värvimine: mikroskoopiameetodid ja tegelike mikrofotode atlas

Metüleensinisega värvimine muudab muidu nõrgalt nähtavad rakustruktuurid heleväljamikroskoopias kergemini eristatavaks. See võib aidata õpilastel leida põseepiteeliraku tuuma või uurida mikroorganismide piirjooni ja paiknemist. Sinine objekt on aga vaatlustulemus. Organismi nimetamine, selle mõõtmine ja otsustamine, kas see viitab haigusele, on eraldi ülesanded.

Kaanepilt illustreerib kontrasti põhimõtet. Allolev atlas sisaldab tegelikke fotosid sõltumatult dokumenteeritud proovidest koos nende algsete allikaandmetega.

Mida metüleensinine esile toob?

Metüleensinine on aluseline värvaine: selle värviline ioon kannab positiivset laengut. Nagu OpenStax proovide värvimist käsitledes selgitab, vastastiktoimivad aluselised värvained negatiivselt laetud rakumaterjaliga ja võivad muuta rakud heledamal taustal paremini nähtavaks. Sobivates preparaatides toob metüleensinine esile nukleiinhapperikkad piirkonnad ja muud värvainet siduvad struktuurid.

Lihtvärvimisel loob kontrasti üks värvaine. Seetõttu võivad eri organismid paista sinised, ilma et tegu oleks sama organismiga. Esialgu on kasulikud kirjeldavad küsimused: kas objektid on ümarad või piklikud, eraldi või kogumikena, ühtlaselt värvunud või sisemiselt eristuvate piirkondadega? Enne värvi tõlgendamist klassifitseerimistulemusena tutvu lihtvärvimise ja Grami järgi värvimise erinevusega.

Kontrast ja lahutusvõime on erinevad omadused. Kontrast aitab eristada objekti selle ümbrusest; lahutusvõime võimaldab eristada lähestikku paiknevaid detaile. Tumedam pilt ei taga, et sellel oleks rohkem eristatavaid struktuure. Samuti ei ole iga tumeda graanuli nimetamine organelliks põhjendatud.

Natiivpreparaadid, värvitud märgpreparaadid ja äigepreparaadid

Värvimata ehk natiivne märgpreparaat võimaldab vaatlust ilma lisatud värvaineta, kuigi algsest keskkonnast eemaldamine muudab proovi siiski. Värvitud märgpreparaadile lisatakse reagent ajal, mil materjal jääb katteklaasi alla vedelikku. Fikseeritud äigepreparaadi puhul laotatakse materjal alusklaasile ja kasutatakse enne edasist töötlemist kindlaksmääratud fikseerimismeetodit. OpenStaxi ülevaade preparaatide valmistamisest eristab märgpreparaate fikseerimisest ja selgitab, miks fikseeritud organismid ei võimalda enam vaadelda normaalset liikumist ega ainevahetust.

Need preparaadid vastavad erinevatele küsimustele:

Õppetunnis võrdlemiseks dokumenteeri värvimata preparaat enne, kui uurid eraldi värvitud preparaati, mis on valmistatud õppejuhendi järgi. Hoia valgustus ja pildistusseaded võrreldavana. Kui pildistatakse kahte erinevat rakku, kirjelda neid näidetena, mitte ühe raku enne-ja-pärast-ülesvõtetena.

Mikroskoopiaatlas: kolm tegelikku värvitud proovi

See atlas on kolme avatud litsentsiga mikrofoto originaalne valik ja tõlgendus. Allikate autorid on määratlenud proovid ja värvained. Me ei ole nende proovide päritolu ega identiteeti sõltumatult kontrollinud. Pildid on reprodutseeritud kärpimata kujul kadudeta WebP-teisendustena, ilma lisatud detailide või värvimuutusteta.

Pilt 1: inimese põseepiteelirakud

Proov: inimese põseepiteelirakud. Värvaine: metüleensinine. Suurendus: 400×, fotograafi andmetel. Mõõtkavariba: puudub; allikas ei esita kalibreeritud pikslisuurust. Foto autor Fritzmann2002, 2017, allikast Inimese põseepiteelirakud (metüleensinisega värvitud), litsentsiga CC BY-SA 4.0. See reproduktsioon säilitab sama litsentsi.

Alusta eraldi paiknevast rakust: selle tumedamat tuuma on lihtsam eristada ümbritsevast sinisest tsütoplasmast. Seejärel uuri selle all paiknevaid kattuvaid rakke. Kattumine raskendab piiri jälgimist ja võib tekitada kohati tumedama piirkonna. Kasuta seda pilti piirjoonte jälgimise harjutamiseks, mitte iga tumeda laigu lugemiseks rakutuumaks. Põseepiteelirakkude vaatlusjuhend käsitleb sellele proovile kohandatud harjutust põhjalikumalt.

Pilt 2: sibularakud

Proov: sibularakud, allika määratluse järgi. Värvaine: metüleensinine. Suurendus: algses failinimes esineb “200x”; seda pole sõltumatult kontrollitud. Mõõtkavariba: puudub; kalibreerimisandmeid ei ole esitatud. Foto autor Alvy16, 2019, allikast Sibularakk 200x, litsentsiga CC BY 4.0.

Piklikud rakuruumid moodustavad korrapärase kihi. Võrdle nende pikki ühiseid piire pildi 1 ebakorrapäraste piirjoontega. Märka ka silmatorkavat tumedat materjali ja vaatevälja ebaühtlast heledust. Foto ei võimalda kindlaks teha iga tumeda ladestuse olemust. See näitab, miks kasulik vaatlusprotokoll hõlmab artefakte ja ebakindlust, selle asemel et omistada nimetus kõigele, mis värvub.

Pilt 3: pärmseened, mille allikas on määratlenud kui Candida spp.

Proov: Candida spp., fotograafi andmetel. Värvaine: lihtne positiivne värvimine metüleensinisega. Suurendus: andmed puuduvad. Mõõtkavariba: puudub; kalibreeritud pikslisuurust ei ole esitatud. Foto autor Marta, Wikimedia kasutaja Martunia.g, 2021, allikast Positiivne värvimine metüleensinisega 2, litsentsiga CC BY 4.0.

Võrdle tihedaid siniseid kogumikke hõredamate äärealadega. Üksikute objektide piirjooni on lihtsam jälgida seal, kus objektid vähem kattuvad. Nimetus Candida pärineb allika andmetest, mitte selle foto põhjal tehtud liigimäärangust. See pilt ei anna ka eluvõimelisuse hindamise tulemust. Pärmseente eluvõimelisuse ja hingamise analüüsid vajavad oma tingimusi, kontrolle ja tõlgendust.

Mõõtkava õige tõlgendamine

Need pildid võimaldavad visuaalset võrdlust, mitte mõõtmist mikromeetrites ega rakkude absoluutse suuruse võrdlemist eri piltide vahel. Esitatud suurendus ei asenda puuduvaid kaamera kalibreerimisandmeid. Pildi kuvamissuuruse muutmine muudab selle näivat suurendust.

Oma piltide jaoks kalibreeri mõõtmine teadaoleva etaloni ja vastava optilise seadistuse abil. Nikoni mikromeetriajuhend selgitab, kuidas objektmikromeeter võimaldab teisendada pildi või mõõtevõrgu suvalised jaotised füüsilisteks pikkusteks. Pane kirja objektiiv, kaamera seadistus ja kalibreerimisandmed ning lisa nende andmete põhjal mõõtkavariba. Ära tuleta mõõtkavariba õpikus toodud keskmisest rakusuurusest.

Kas pudeli sisu sobib meetodiga?

Metüleensinise sildiga pudel ei anna täielikku laboratoorset spetsifikatsiooni. Kontrolli kontsentratsiooni ja ühikuid, lahustit, lisakoostisosi, ettenähtud kasutusotstarvet, partii dokumentatsiooni ja juhiseid. Reagendi ohutuskaart kirjeldab ohte; meetodi juhised määravad, kuidas seda ettenähtud preparaadi jaoks kasutada.

Konkreetne näide on Mercki Löffleri metüleensinise lahus. Tootja määratleb selle mikroskoopiareagendina ja kirjeldab selle rolli järelvärvina happekindlate mikroorganismide värvimisel. Ka selle märgitud tuleohtlikkus näitab, miks „sinine vedelik” ei ole piisav teave käitlemise või kuumutamise kavandamiseks. Need omadused kehtivad selle koostise kohta, mitte automaatselt iga metüleensinise vesilahuse kohta.

Samuti on eosiin-metüleensinine agar kindla koostisega sööde. See ei ole mikroskoobipreparaadi värv, mis saadakse lihtsalt metüleensinise lisamisel proovile. Teistsuguse vaatlusülesande jaoks võrdle metüleensinise alternatiive mikroskoopias.

Algaja mikroskoobikomplekti puhul alusta selle dokumenteeritud õppemeetodist, teadaolevatest valmispreparaatidest ja ettenähtud reagendist. Kui pudeli silt on kadunud või selle koostist ei saa kindlaks teha, asenda see sobiva dokumenteeritud reagendiga. Kasuta silmakaitset ja järgi konkreetse koostisega toote jaoks antud käitlemisjuhiseid. Inimmaterjali ja tundmatute keskkonnaproovide puhul tuleb järgida õppelabori proovide käitlemise ja kõrvaldamise protseduure; värvimine ei asenda neid protseduure.

Pane vaatlustulemus kirja enne järeldust

„Sinised ovaalsed objektid kogumikena” on põhjendatud pildikirjeldus. „Konkreetne nakkus” nõuab tõendeid, mida pilt ei ole andnud. Hoia märkmikus lahus proovi päritolu, preparaadi valmistamine, värvimisreaktsioon ja tuvastamismeetod. See eristus muudab lihtsa õppetunnis tehtud pildi kasulikuks ja takistab ilusa mikrofoto kasutamist väite toetuseks, mida see ei suuda tõendada.