Kuidas metüleensinine rakkudesse siseneb: redutseerimine, taasoksüdeerimine, omastamine

Kui jälgida, kuidas endoteelirakud katseanumas metüleensinist omastavad, tundub järeldus ilmne, kuid see on vale. Sööde kaotab sinise värvuse ja rakkudesse ilmuvad sinised graanulid, seega pidi värvaine läbima membraani sinise molekulina. Katsed näitavad muud. Sinine vorm läbib membraani vaid väga vähesel määral. Membraani läbib värvitu vorm ning raku sees nähtav sinine vorm tekib seal alles pärast sisenemist.

See vastupidine sündmuste käik on oluline, sest määrab, mida värvumine saab ja mida ei saa näidata. Sinised graanulid näitavad oksüdeeritud värvainet, mis on taasoksüdeerunud ja organellidesse kinni jäänud. Need ei näita värvaine koguhulka rakus ega selle redutseeritud varu ning ei mõõda bioloogilist toimet. Põhjuse mõistmiseks tuleb jälgida kolme etappi: redutseerimist rakupinnal, redutseeritud vormi difusiooni ning rakusisest taasoksüdeerimist ja kinnijäämist.

Kaks vormi käituvad nagu erinevad molekulid

Oksüdeeritud metüleensinine on tasapinnaline, positiivselt laetud tsükliline süsteem. See lahustub vees, neelab tugevalt valgust ligikaudu 600 kuni 700 nanomeetri juures ja paistab sinine. Võtmetähtsusega on laeng. Laetud hüdrofiilne molekul ei läbi lipiidmembraani hõlpsasti, mistõttu kirjanduses kasutatakse ettevaatlikku sõnastust: membraan on sellele suhteliselt läbimatu, mitte täiesti läbimatu.

Redutseeritud metüleensinine, mida nimetatakse leukometüleensiniseks, on värvitu, laenguta ja rasvlahustuv. Laengu eemaldamisel ei ole membraan enam tõke. Redutseeritud molekul difundeerub hõlpsasti läbi membraani ning võib oksüdeerivamasse rakusisesesse ruumi jõudes taas elektrone loovutada ja muutuda tagasi siniseks, laetud vormiks, mis jääb sinna kinni. Seega on värvaine redokskeemia ühtlasi selle transpordimehhanism. Elektronide arvu muutmine muudab ka membraani läbitavust.

Esimese etapi elektronid pärinevad rakust endast. Imetajarakkudes toimub elektronide transport läbi plasmamembraani: redutseerivad ekvivalendid liiguvad rakusisestelt doonoritelt väljapoole, rakupinnal asuvatele aktseptoritele. See plasmamembraani läbiv aktiivsus on tavapärane rakufunktsioon, mida leidub enamikus rakutüüpides. Tiasiinvärvaineid redutseeriv endoteeli pinnareduktaas käitub ühes kõnekas aspektis nagu teisedki: see jätkab tööd tsüaniidi ja asiidi juuresolekul annustes, mis peatavad hilisemad etapid. See etappide eristumine on kogu loo keskne punkt.

Kõigepealt uuriti jaotumist ning see peaaegu selgitas omastamist

aastal esitas Rockefelleri instituudis töötanud Marian Irwin lihtsama küsimuse. Võib-olla tähendab värvaine sisenemine lihtsalt jaotumist vee ja raku rasvakihtide vahel ning kloroformikiht võiks neid rasvakihte laborikatses esindada. Oma spektrofotomeetrilistes läbitungimisuuringutes loksutas ta värvainete vesilahuseid kloroformiga ning võrdles orgaanilisse faasi liikunud aineid nendega, mis sisenesid elusatesse vetikarakkudesse.

Kaks selle töö tulemust väärivad endiselt tähelepanu. Esiteks sisaldasid kaubanduslikud metüleensinise lahused trimetüültioniini, mida nüüd nimetatakse azure B-ks, ning see lisand tungis rakkudesse kiiremini kui metüleensinine ise, eriti aluselise pH juures, kus domineerib lipiidlahustuv vaba aluse vorm. Osa näilisest metüleensinise sisenemisest oli tegelikult azure B valikuline sisenemine. Teiseks määras pH tulemuse ionisatsiooniastme kaudu ning kahjustatud rakud lasid sisse palju rohkem värvainet kui terved rakud. Jaotuskoefitsiendid ja laenguolek määrasid, mida kunstlik süsteem ja elusrakk kumbki omastasid, ning nende sarnasus toetas mõtet mittevesipõhistest kihtidest rakupiiril.

Mudel nägi lipiidide ja ionisatsiooni rolli ettenägelikult, kuid ei suutnud eristada värvainet, mis jaotub muutumatul kujul, värvainest, mis muundatakse pinnal keemiliselt, läbib membraani teisel kujul ja muundatakse raku sees tagasi. Selle eristamiseks oli vaja teistsugust katset, mis tehti seitsekümmend aastat hiljem kopsuendoteeliga.

Redutseerimine väljaspool, kinnijäämine seespool

Merker ja tema kolleegid töötasid kultiveeritud veise kopsuarteri endoteelirakkudega ning pakkusid välja kolmeetapilise järjestuse: oksüdeeritud värvaine redutseeritakse rakupinnal värvituks lipofiilseks vormiks, redutseeritud vorm difundeerub rakku ning rakusisene taasoksüdeerimine taastab membraani mitteläbiva oksüdeeritud vormi, mis koguneb rakku. Seejärel kontrolliti nende tiasiinvärvainete endoteelirakkudesse omastamise uuringus seda järjestust, püüdes seda kindlates kohtades katkestada.

Esimene vahend oli ferritsüaniid, elektronaktseptor, mis ei saa rakku siseneda. Kui pinnaensüümid redutseerivad sinise värvaine väljaspool rakku värvituks vormiks, saab ferritsüaniid need elektronid tagasi võtta ja taastada söötmes sinise värvaine enne, kui see jõuab membraani läbida. Kuni ferritsüaniidi oli liias (10 mikromolaarset värvainet võrreldes 50 kuni 500 mikromolaarse ferritsüaniidiga), peatus värvaine omastamine peaaegu täielikult. Alles pärast ferritsüaniidi äratarvitamist jätkus omastamine tavapärase kiirusega. Kineetika kinnitas sama selgitust teisel viisil. Ferritsüaniid kadus ligikaudu püsiva kiirusega, mis oli kooskõlas ühtlase pinnareduktsiooni vooga, mida vahendas korduvkasutatav mediaator. Rakuväline värvaine kadus aga eksponentsiaalselt, sedamööda kuidas selle varu vähenes. Püsiv voog koos väheneva varuga tähendab, et ferritsüaniidi signaal näitab pidevat redutseerimist, mitte värvainemolekulide lahusest lahkumist.

Teise vahendiga kõrvaldati membraani läbimise etapp täielikult. Uurimisrühm sidus lähedase tiasiinvärvaine toluidiinsinise O suure polüakrüülamiidahela külge, mis oli kummaski oksüdatsiooniastmes rakku sisenemiseks liiga suur. Rakud redutseerisid seotud värvainet ikkagi. Seega ei vaja redutseerimine rakusisest ligipääsu. Vastav mehhanism asub pinnal või on sellega elektriliselt seotud.

Seejärel ilmnes etappide eristumine, millele viitab ka artikli pealkiri. Tsüaniid ja asiid kontsentratsioonil 2 millimolaarset pärssisid tugevalt värvaine kogunemist ning mikroskoobis olid tavaliselt tuuma ümbritsevad tumesinised ja lillad inklusioonid peaaegu kadunud. Kumbki inhibiitor ei aeglustanud aga rakuvälist redutseerimist: ferritsüaniidi tsükkel jätkus muutumatu aktiivsusega ning membraani mitteläbivat polümeeri redutseeriti endiselt. Blokeering asus hilisemas etapis. Tsüaniid ja asiid peatasid rakusisese taasoksüdeerimise ja eraldatud ruumidesse kinnijäämise, mitte pinnal toimuva redutseerimise. Seda tõlgendust toetasid eluvõimelisuse kontrollkatsed: rakud säilitasid nende töötluste ajal tsütosoolse markerensüümi laktaatdehüdrogenaasi, mistõttu ei olnud omastamise kadumine lihtsalt mürgistuse või membraani purunemise tagajärg.

Üks uuringus esitatud ettevaatusmärkus kehtib endiselt. Sinised inklusioonid paiknesid tuuma ümber, kuid mitte tuumas, mis sobib kokku oksüdeerumisega rakusisestes organellides. Uuring ei tuvastanud siiski, millistes organellides see toimus. Sarnaseid mustreid teistes rakutüüpides oli nappide tõendite põhjal nimetatud lüsosomaalseteks. Kinnijäämist võib pidada tõendatuks, kuid selle täpset asukohta esialgseks. Lugejad, kes soovivad jälgida elektronide edasist teekonda, võivad jätkata teemadega mitokondriaalne elektrontransport ja redoksprotsessid ning laiema ülevaatega imendumisest ja jaotumisest manustamistee järgi.

Värvumine ei näita kokkupuudet ainega

Kolmas uuring näitab, mis juhtub, kui selle omastamismehhanismi kõrval mõõdetakse bioloogilist näitajat. Scott ja tema kolleegid leidsid, et metüül-beeta-tsüklodekstriin, rõngakujuline suhkrutoroid, seob metüleensinist otseselt. Inklusioonkompleksi assotsiatsioonikonstant on ligikaudu 310 pöördmolaarset ühikut, võrreldes värvaine dimeriseerumise ligikaudu 5846 pöördmolaarse ühikuga. L929 fibroblastides blokeeris see seondumine nii rakkude värvumise kui ka glükoosi omastamise stimuleerimise: eelinkubeerimine tsüklodekstriiniga takistas sinist värvumist ning selle hilisem lisamine kiirendas värvuse kadumist. Kui optiline sinine signaal rakkudest kadus, vaibus sellega tihedalt paralleelselt ka aktiveeritud glükoositransport.

Autorid tõlgendasid seda korrelatsiooni nii, et see toetab pigem värvaine otsest vastastikmõju mõne glükoositransporteri aktiveerimisrajas osaleva valguga kui pikaajalist oksüdatiivse stressi mehhanismi. See järeldus on põhjendatud, kuid piiratud. Katse ei tuvasta valku, ei näita seondumist transporteri endaga ning värvuse kadumise ja toime kadumise vaheline korrelatsioon ei välista kõiki redoksprotsesside vahendatud radu.

Püsiv õppetund puudutab mõõtmist. Optiline värvumine näitab nähtavat, oksüdeeritud, rakuga seotud värvainet. Värvitu redutseeritud varu jääb täielikult nähtamatuks, seega võib ka kahvatuna näiv rakk sisaldada värvaine ekvivalente. Intensiivselt värvunud rakk näitab aga kinni jäänud oksüdeeritud värvainet, mitte koe üldist kokkupuudet ainega ega toime suurust. Sama ettevaatus kehtib suuremas mõõtkavas: eri rakutüüpide värvumise võrdlemine või tumeda koelõigu käsitamine suurema ainega kokkupuute tõendina kordab katseanuma vaatlemisel tehtud algset viga. Omastamine on redutseerimise, difusiooni ja taasoksüdeerimise tsükkel ning iga üksik sinise vormi hetkepilt näitab sellest vaid üht osa. Sellest tulenevad otseselt praktilised järeldused nii laboratoorse värvimise ja käsitsemise kui ka annust ja ainega kokkupuudet puudutavate väidete tõlgendamise jaoks.