Azul de metileno y Bartonella: hallazgos de laboratorio y límites de la evidencia clínica

Una placa de cultivo y un paciente comparten una palabra, infección, pero no un concepto. En la placa, la infección es un recuento de colonias en agar. En el paciente, son bacterias dentro de células y vasos, fármacos desplazándose por la sangre y los tejidos, y un sistema inmunitario realizando parte del trabajo. Confundir ambos hace que un número de laboratorio llamativo empiece a parecer un tratamiento. Mantenerlos separados permite que el mismo número sea lo que realmente es: una razón para realizar el siguiente experimento.

Esa separación es todo el objetivo de esta revisión sobre azul de metileno y Bartonella. Dos estudios de laboratorio de un mismo grupo de investigación probaron azul de metileno contra Bartonella henselae en estados sin crecimiento. Ambos informaron una actividad fuerte en vidrio y plástico. Ninguno probó en una persona.

Por qué los investigadores prueban la fase estacionaria

La mayoría de las pruebas con antibióticos utilizan células en crecimiento. Ese modelo no aborda un caso más difícil: células que han dejado de dividirse y toleran fármacos que eliminan a sus equivalentes en crecimiento.

Bartonella puede persistir en el organismo, incluso dentro de eritrocitos y células endoteliales. Por eso el grupo preguntó qué fármacos aprobados pueden eliminar B. henselae después de entrar en fase estacionaria. Una MIC baja contra células en crecimiento no predijo la eliminación en fase estacionaria. La rifampicina tuvo una MIC muy baja, pero eliminó mal las células estacionarias, mientras que compuestos con valores de MIC más altos las eliminaron bien. Los lectores que quieran un método general para este tipo de artículo lo encontrarán en la guía para leer investigaciones sobre azul de metileno.

Primer cribado: Li y colaboradores, 2019

El cribado de fase estacionaria de 2019 en Antibiotics utilizó una única cepa, B. henselae JK53, cultivada en medio Schneider con 10 por ciento de suero fetal bovino a 37 C con 5 por ciento de CO2. Los cultivos de un día eran principalmente células dispersas en división. Los cultivos de cinco días, con alrededor de 10 a la 8 unidades formadoras de colonias por mL, se consideraron fase estacionaria y contenían agregados visibles.

El ensayo fue SYBR Green I con yoduro de propidio, calibrado frente a mezclas de células vivas y células eliminadas con isopropanol. Debido a que el azul de metileno tiene un color intenso, los resultados positivos se confirmaron mediante microscopía y después mediante recuentos de colonias en agar sangre, el criterio de valoración más estricto.

De 1.581 fármacos aprobados a 50 micromolar, el azul de metileno dejó un 16 por ciento de viabilidad mediante lector de placas y un 25 por ciento mediante microscopía. La daptomicina obtuvo un 21 por ciento, varios azoles obtuvieron entre 22 y 27 por ciento, la gentamicina un 32 por ciento, la eritromicina un 66 por ciento y la ciprofloxacina un 74 por ciento. El pamoato de pirvinio pareció más potente en el lector, pero no pudo puntuarse mediante microscopía debido a su propia fluorescencia.

Contra B. henselae en crecimiento, la MIC del azul de metileno fue de 0.08 a 0.16 microgramos por mL. Contra células estacionarias de cinco días a 5 microgramos por mL, el recuento de colonias cayó hasta colonias no detectables después de un día de exposición, igualando a la daptomicina y al pamoato de pirvinio en sus concentraciones probadas. Una prueba separada de eliminación en función del tiempo utilizó 10 microgramos por mL. Esos son niveles de exposición de laboratorio, no dosis, y el artículo los presenta como tales. Un valor humano de concentración plasmática máxima cercano a 3.9 microgramos por mL citado en el artículo aparece únicamente como contexto de referencia. La descripción general de la farmacocinética del azul de metileno explica por qué un valor plasmático no puede interpretarse como un valor tisular.

Dos limitaciones son explícitas en el artículo. No hubo un modelo de biopelícula ni pruebas de combinaciones con azul de metileno. Los agregados de cinco días eran grupos en cultivo líquido estacionario, no un experimento validado de biopelícula. Los autores solicitaron estudios en animales, estudios de combinaciones, estudios de biopelículas y pruebas en otras especies de Bartonella.

Combinaciones y células derivadas de biopelículas: Zheng y colaboradores, 2020

El seguimiento de 2020 en BMC Microbiology mantuvo la misma cepa y medio, pero pasó a cultivos estacionarios de seis días y añadió dos elementos que faltaban en el primer artículo: combinaciones de dos fármacos y un modelo de células derivadas de biopelícula.

Para fármacos individuales a una concentración uniforme de 5 microgramos por mL durante 24 horas, el azul de metileno dejó 3.2 veces 10 a la 4 unidades formadoras de colonias por mL frente a un control cercano a 2.8 veces 10 a la 10. La ciprofloxacina, la gentamicina y la nitrofurantoína dejaron menos colonias en el mismo punto. Esto difiere del resultado de 2019, donde el mismo nivel nominal produjo colonias no detectables después de un día. La edad del cultivo, la densidad y el manejo fueron diferentes, por lo que la eliminación fue reproducible en dirección, pero no idéntica en magnitud. Esta variación entre ensayos es una de las razones por las que las comprobaciones estándar de seguridad e interacciones tratan la potencia de laboratorio como algo separado del efecto clínico.

El cribado de combinaciones es la parte más citada. Cada componente se fijó en 5 microgramos por mL. Tanto azitromicina más azul de metileno como rifampicina más azul de metileno produjeron colonias estacionarias no detectables a las 24 horas, al igual que ambas combinaciones con ciprofloxacina, y únicamente esas cuatro entre 25 pares probados. No se realizó un análisis formal de sinergia, por lo que el término correcto es combinación activa bajo estas condiciones, no sinergia demostrada.

El experimento de biopelícula probó células recuperadas de una biopelícula joven alterada, no penetración en una biopelícula madura intacta. Los cultivos crecieron durante cinco días, se diluyeron en placas de pocillos durante cinco días adicionales, se confirmaron mediante tinción con cristal violeta y después se rasparon antes de la exposición al fármaco. A 5 microgramos por mL, el azul de metileno solo descendió a 2.3 veces 10 a la 2 para el día 6, entre los mejores agentes individuales, pero no a cero. Ambas combinaciones con azul de metileno alcanzaron cero para el día 6, al igual que ambas combinaciones con ciprofloxacina.

Los autores señalaron las mismas limitaciones que observaría un lector cuidadoso: una biopelícula joven raspada en lugar de una biopelícula antigua intacta, una concentración conveniente para todos los fármacos en lugar de cada fármaco a su nivel máximo realista, solo pares seleccionados centrados en azitromicina o rifampicina, una cepa, sin animales y sin pacientes. Se propuso trabajo posterior con tres fármacos, pero no se informó.

Comparación del diseño del estudio

La tabla es el punto de este artículo en forma compacta. Todo lo que queda a la izquierda de la última columna es trabajo de cultivo. Nada en ninguno de los dos artículos ocupa la última columna.

Bartonella no es Borrelia

Ambos artículos mencionan Borrelia burgdorferi, la espiroqueta de la enfermedad de Lyme, porque el ensayo con colorante procedía de trabajos anteriores sobre fase estacionaria de Borrelia en el mismo laboratorio, donde el azul de metileno y la daptomicina también habían obtenido resultados positivos. Ese historial es un contexto útil y una fuente común de error.

Ningún experimento de los dos artículos sobre Bartonella prueba Borrelia junto con Bartonella. Los organismos son diferentes, los medios son diferentes, las concentraciones son diferentes y el supuesto efecto de membrana del azul de metileno en Bartonella fue presentado como una especulación que necesita más estudio. Los resultados no deben trasladarse entre especies, y ninguno de los dos artículos respalda afirmaciones generales sobre parásitos. La comparación de los persistentes de Borrelia y Bartonella mantiene separadas ambas literaturas por este motivo.

Por qué los cultivos no se convierten en un protocolo

El interés de búsqueda en un protocolo de azul de metileno para bartonella es comprensible. Estos artículos explican por qué esa frase debería tratarse como una señal de advertencia y no como una lista de compras.

Primero, 5 microgramos por mL en un pocillo no es una receta. No tiene asociados absorción, distribución, unión a proteínas, penetración intracelular ni tolerabilidad. Los autores lo eligieron como un promedio aproximado de picos de antibióticos y señalaron que los trabajos futuros deberían utilizar cada fármaco a su propio nivel realista.

Segundo, cero colonias significa que no hubo colonias bajo esas condiciones de siembra, no que el tejido esté estéril. Los persistentes, las bacterias intracelulares y los límites de muestreo quedan fuera de la placa de agar.

Tercero, las combinaciones que esterilizan un pocillo pueden fallar o causar daños en un organismo. Azitromicina más azul de metileno y rifampicina más azul de metileno son pares de laboratorio con exposiciones de laboratorio. Sin farmacocinética en animales y datos humanos controlados no existe una dosis, una duración ni una relación beneficio-riesgo. Quienes estén considerando opciones deberían hablar con un profesional sanitario y revisar cuándo el uso de azul de metileno requiere supervisión médica antes de extraer cualquier conclusión de datos de placas.

La conclusión limitada que sí respaldan estos artículos es la siguiente: el azul de metileno tiene actividad reproducible contra B. henselae JK53 sin crecimiento in vitro, incluidas combinaciones de dos fármacos en laboratorio, con los resultados más sólidos de combinación y derivados de biopelícula procedentes del estudio de 2020. Todo lo demás, incluido si esa actividad tiene relevancia para la bartonelosis humana, sigue sin estar probado.