Κυανό του μεθυλενίου, tau και αμυλοειδές: γιατί διαφέρουν οι μηχανισμοί απομάκρυνσης πρωτεϊνών

Αν ρωτήσετε τι κάνει το κυανό του μεθυλενίου στις πρωτεΐνες της νόσου Αλτσχάιμερ, θα ακούσετε μία κατηγορηματική απάντηση εκεί όπου θα έπρεπε να ακούσετε τρεις απαντήσεις με επιφυλάξεις. Σε δοκιμαστικό σωλήνα παρεμποδίζει τη σύνδεση της tau με τον εαυτό της. Σε ένα μοντέλο ποντικού μειώνει το διαλυτό αμυλοειδές χωρίς να επηρεάζει την tau. Σε ένα άλλο μειώνει τη δραστηριότητα του ενζύμου που παράγει εξαρχής το αμυλοειδές. Κάθε ένα από αυτά τα ευρήματα είναι πραγματικό. Κανένα δεν αποτελεί ολόκληρη την εικόνα και δεν συμβαίνουν όλα στο ίδιο ζώο την ίδια στιγμή. Αυτό το άρθρο διαχωρίζει τα τρία, ώστε ένα αποτέλεσμα από ένα πείραμα να πάψει να παρατίθεται ως απόδειξη για κάποιο άλλο.

Οι αναγνώστες που θέλουν την ευρύτερη εικόνα για το πώς δρα το κυανό του μεθυλενίου μέσα στα κύτταρα θα πρέπει να ξεκινήσουν από εκεί. Όσοι θέλουν να μάθουν αν κάποιο από αυτά βοήθησε ασθενείς θα πρέπει να διαβάσουν τα κλινικά δεδομένα για τη νόσο Αλτσχάιμερ, όπου ανήκουν τα αποτελέσματα των δοκιμών σε ανθρώπους. Το παρόν άρθρο δεν επαναλαμβάνει αυτά τα δεδομένα.

Το εύρημα για την tau αφορά δοκιμασίες συσσωμάτωσης

Η παλαιότερη από τις τρεις ερευνητικές ιστορίες προέρχεται από μελέτες χωρίς κύτταρα για την tau, την πρωτεΐνη που σχηματίζει νευροϊνιδιακά δεμάτια. Στη δοκιμασία σύνδεσης tau-tau, τμήματα της tau συναρμολογούνται σε ζεύγη ελικοειδών νηματίων και οι χρωστικές φαινοθειαζίνης, μεταξύ των οποίων το κυανό του μεθυλενίου, εμποδίζουν αυτή τη συναρμολόγηση σε χαμηλές συγκεντρώσεις της τάξης των micromolar. Μεταγενέστερες βιοχημικές μελέτες έδωσαν μια χημική εξήγηση: η χρωστική οξειδώνει κατάλοιπα κυστεΐνης στην tau, σταθεροποιώντας τη μονομερή μορφή και καταστέλλοντας τα ινίδια που διαφορετικά θα αναπτύσσονταν. Οι αναφερόμενες ανασταλτικές συγκεντρώσεις για τη συσσωμάτωση της tau κυμαίνονται περίπου από μονοψήφιες τιμές έως λίγες δεκάδες micromolar, ένα εύρος που έχει σημασία για όλα όσα ακολουθούν.

Προσέξτε τι είδους ισχυρισμός είναι αυτός. Δεν λέει τίποτε για την παραγωγή της tau, τη φωσφορυλίωσή της σε έναν ζωντανό εγκέφαλο ή την απομάκρυνσή της. Λέει ότι, υπό καθορισμένες συνθήκες σε δοκιμαστικό σωλήνα, η οξειδωμένη χρωστική εμποδίζει τη διαδοχική στοίβαξη της tau. Πρόκειται για ένα ακριβές, περιορισμένο και χρήσιμο αποτέλεσμα. Το πρόβλημα αρχίζει όταν αυτό διευρύνεται σε μια γενική δήλωση ότι το κυανό του μεθυλενίου απομακρύνει την παθολογία της tau, επειδή τα δεδομένα από ζώα δεν συμφωνούν με αυτή την εκδοχή.

Το εύρημα για το πρωτεάσωμα αφορά ποντικούς 3xTg-AD και διαχώρισε το αμυλοειδές από την tau

Το σαφέστερο πείραμα με αποκλίνοντα καταληκτικά σημεία είναι μια διατροφική μελέτη 16 εβδομάδων σε ποντικούς που έφεραν τρεις μεταλλάξεις σχετιζόμενες με τη νόσο Αλτσχάιμερ. Τα ζώα έτρωγαν τροφή που περιείχε κυανό του μεθυλενίου από την ηλικία των έξι μηνών και οι ερευνητές μέτρησαν ταυτόχρονα τρία πράγματα: το πρωτεάσωμα, τα επίπεδα αμυλοειδούς και την tau.

Η δραστηριότητα του πρωτεασώματος άλλαξε. Η δραστηριότητα τύπου χυμοθρυψίνης αυξήθηκε περίπου κατά ένα τέταρτο και η δραστηριότητα τύπου θρυψίνης περίπου κατά το ήμισυ, ενώ η τρίτη καταλυτική δραστηριότητα δεν μεταβλήθηκε σημαντικά. Το διαλυτό β-αμυλοειδές 40 και 42 μειώθηκε κατά περίπου ένα τέταρτο για κάθε μορφή. Οι συγγραφείς ερμήνευσαν αυτό το αποτέλεσμα ως αυξημένη απομάκρυνση και όχι ως μειωμένη παραγωγή, επειδή η πρόδρομη πρωτεΐνη και τα θραύσματα από την επεξεργασία της δεν άλλαξαν, ενώ η μάθηση και η μνήμη βελτιώθηκαν στη δοκιμασία ελέγχου του υδάτινου λαβυρίνθου.

Και έπειτα ήρθαν οι αποκλίσεις. Το αδιάλυτο αμυλοειδές δεν άλλαξε. Η χρώση για πλάκες δεν άλλαξε. Η συνολική ανθρώπινη tau και η φωσφορυλιωμένη tau στη θρεονίνη 181 δεν άλλαξαν, ούτε άλλαξε η μη φυσιολογική εντόπιση της tau. Ούτε οι μιτοχονδριακές μετρήσεις άλλαξαν: δεν υπήρξε σημαντική επίδραση στη δραστηριότητα της οξειδάσης του κυτοχρώματος c, στην πρωτεΐνη της οξειδάσης ή στο ATP. Επομένως, σε αυτό το μοντέλο και με αυτό το σχήμα χορήγησης, το κυανό του μεθυλενίου αύξησε δύο από τις τρεις δραστηριότητες του πρωτεασώματος, μείωσε το διαλυτό αμυλοειδές, αποκατέστησε μια συμπεριφορική παράμετρο και άφησε αμετάβλητα τα καταληκτικά σημεία της tau, το αδιάλυτο αμυλοειδές και τα μιτοχονδριακά καταληκτικά σημεία που εξετάστηκαν.

Μια επιφύλαξη κάνει το συμπέρασμα σαφέστερο αντί να το αποδυναμώνει. Αυτοί οι ποντικοί δεν είχαν ακόμη αναπτύξει συσσωματώματα tau στην ηλικία που εξετάστηκαν, επομένως το πείραμα δεν μπορεί να δείξει ότι το κυανό του μεθυλενίου δεν δρα κατά των δεματίων tau. Δείχνει ότι το διαλυτό αμυλοειδές μπορεί να μειωθεί ενώ τα μετρούμενα καταληκτικά σημεία της tau παραμένουν αμετάβλητα, δηλαδή ακριβώς το είδος αποτελέσματος όπου μια πρωτεΐνη αλλάζει και μια άλλη όχι, το οποίο χρειάζεται αυτό το θέμα. Αν ξεκινήσατε την ανάγνωση πιστεύοντας ότι η ενεργοποίηση του πρωτεασώματος από το κυανό του μεθυλενίου απομακρύνει μαζί και τις δύο χαρακτηριστικές πρωτεΐνες, αυτή η μελέτη διορθώνει την αντίληψή σας.

Το εύρημα για την παραγωγή αμυλοειδούς αφορά ηλικιωμένους ποντικούς PSAPP και αντιφάσκει με τον προηγούμενο μηχανισμό

Μια διαφορετική ομάδα, ένα διαφορετικό μοντέλο και η αντίθετη εξήγηση για το αρχικό στάδιο της διαδικασίας. Σε μια τρίμηνη μελέτη χορήγησης μέσω γαστρικού καθετήρα σε ποντικούς PSAPP ηλικίας 15 μηνών, μια ημερήσια από του στόματος δόση 3 mg/kg μείωσε το φορτίο πλακών σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου κατά περίπου ένα τρίτο έως το ήμισυ και μείωσε αρκετά κλάσματα αμυλοειδούς, μεταξύ των οποίων ολιγομερή που μετρήθηκαν με ειδική δοκιμασία. Εδώ όμως ο προτεινόμενος μηχανισμός ήταν η μειωμένη παραγωγή, όχι η ταχύτερη απομάκρυνση: η πρωτεΐνη BACE1 στον εγκέφαλο μειώθηκε, το προϊόν της C99 μειώθηκε, αλλά το αγγελιαφόρο RNA δεν μειώθηκε, κάτι που υποδεικνύει επίδραση στο επίπεδο της πρωτεΐνης και όχι μειωμένη γονιδιακή έκφραση.

Οι κυτταρικές μελέτες ενίσχυσαν αυτή την ερμηνεία. Σε μια δοκιμασία χωρίς κύτταρα με ανασυνδυασμένο ένζυμο, το κυανό του μεθυλενίου ανέστειλε άμεσα την BACE1, ενώ σε κύτταρα ωοθήκης χάμστερ που εξέφραζαν την ανθρώπινη πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς, το εκκρινόμενο αμυλοειδές 40 και 42 μειώθηκε σε συγκεντρώσεις ακόμη και 1.56 micromolar, ενώ η ίδια η πρόδρομη πρωτεΐνη παρέμεινε αμετάβλητη. Συγκρίνετε αυτό το αποτέλεσμα με την προηγούμενη μελέτη, όπου τα θραύσματα από την επεξεργασία της πρόδρομης πρωτεΐνης παρέμειναν αμετάβλητα και η επίδραση αποδόθηκε στην απομάκρυνση. Δεν μπορούν και τα δύο να περιγράφουν τον ίδιο καθολικό μηχανισμό, επειδή διαφέρουν τα μοντέλα, οι ηλικίες, οι δόσεις, οι οδοί χορήγησης και οι διάρκειες. Αυτό ακριβώς είναι το ζητούμενο. Οι επιδράσεις του κυανού του μεθυλενίου στο αμυλοειδές εκδηλώνονται μέσω της παραγωγής σε ένα πειραματικό πλαίσιο και μέσω της απομάκρυνσης σε ένα άλλο, και η παράθεση οποιουδήποτε από τα δύο χωρίς το πλαίσιό του είναι παραπλανητική.

Μία χημεία, πολλοί στόχοι: η σύνδεση μέσω της οξείδωσης της κυστεΐνης

Μια τρίτη ερευνητική κατεύθυνση εξηγεί πώς η ίδια οξειδοαναγωγική χημεία μπορεί να εμφανίζεται σε άσχετες μεταξύ τους πρωτεϊνικές διεργασίες. Σε μια βιοχημική μελέτη αναστολής κασπασών, το κυανό του μεθυλενίου αδρανοποίησε την κασπάση-6 οξειδώνοντας την καταλυτική κυστεΐνη της σε σουλφενικό οξύ, όπως επιβεβαιώθηκε με φασματομετρία μάζας, με συγκέντρωση για το ήμισυ της μέγιστης επίδρασης κοντά στα 10.6 micromolar. Η κασπάση-3 ανεστάλη σε παρόμοια συγκέντρωση. Οι συγγραφείς συνέδεσαν ρητά αυτό το εύρημα με τη βιβλιογραφία για την tau: η ίδια χημεία οξείδωσης της κυστεΐνης που προτείνεται ότι διατηρεί την tau στη μονομερή μορφή μπορεί να αδρανοποιήσει μια πρωτεάση κυστεΐνης, και οι δραστικές συγκεντρώσεις αλληλεπικαλύπτονται.

Αυτό είναι μια κομψή εξήγηση, αλλά και μια προειδοποίηση. Ένα οξειδοαναγωγικά ενεργό μόριο που οξειδώνει εκτεθειμένα κατάλοιπα κυστεΐνης θα έχει περισσότερους από έναν στόχους σε οποιαδήποτε δραστική συγκέντρωση. Η αποσυσσωμάτωση της tau, η δράση στις κασπάσες και ενδεχομένως άλλες διεργασίες μοιράζονται το ίδιο χημικό «ρήμα», αλλά με διαφορετικά «ουσιαστικά». Αυτό το κοινό ρήμα δεν καθιστά τα ευρήματα εναλλάξιμα. Σημαίνει ότι η δόση και το πλαίσιο καθορίζουν ποιος στόχος έχει σημασία και ότι η χρόνια χορήγηση με στόχο μία διεργασία που εξαρτάται από την κυστεΐνη μπορεί να επηρεάζει και άλλες, ένα ζήτημα που έθεσαν άμεσα οι συγγραφείς της μελέτης των κασπασών. Συναφή ερωτήματα για το πώς η οξειδοαναγωγική χημεία του κυανού του μεθυλενίου επιλέγει τους στόχους της, τι συνεπάγεται η ενεργοποίηση του πρωτεασώματος για άλλες συσσωματωμένες πρωτεΐνες και αν η μακροχρόνια χορήγηση μεταβάλλει το προφίλ των στόχων αξίζουν το καθένα ξεχωριστή ανάλυση.

Μηχανισμός ανά καταληκτικό σημείο: ποιο εύρημα αντιστοιχεί σε ποιο μοντέλο

Διαβάστε τον πίνακα γραμμή προς γραμμή και το δίδαγμα είναι σαφές. Καμία γραμμή δεν παρουσιάζει μεταβολή σε κάθε στήλη. Το ισχυρότερο αποτέλεσμα για την παραγωγή αμυλοειδούς προέρχεται από τη μελέτη που δεν εξέτασε ποτέ το πρωτεάσωμα. Το ισχυρότερο αποτέλεσμα για το πρωτεάσωμα προέρχεται από τη μελέτη όπου η επεξεργασία της πρόδρομης πρωτεΐνης δεν μεταβλήθηκε καθόλου. Το αποτέλεσμα για την tau προκύπτει κυρίως από δοκιμαστικούς σωλήνες και από χημικές διεργασίες που αφορούν επίσης ένζυμα εκτός του επιδιωκόμενου στόχου. Όποιος συγχωνεύει αυτές τις στήλες σε έναν ενιαίο ισχυρισμό, ότι το κυανό του μεθυλενίου απομακρύνει τις παθολογικές πρωτεΐνες ως κατηγορία, γράφει μια ανασκόπηση ενός πειράματος που δεν πραγματοποιήθηκε ποτέ.

Η ίδια πειθαρχία ισχύει και για τους ασθενείς. Το αν αυτοί οι μηχανισμοί οδηγούν συνολικά σε κλινικό όφελος είναι ένα ξεχωριστό ερώτημα, με τις δικές του δοκιμές και τα δικά του συμπεράσματα, και απαντάται στην ενότητα για τα κλινικά δεδομένα της νόσου Αλτσχάιμερ και όχι εδώ.