Κυανό του μεθυλενίου και πολλαπλή σκλήρυνση: τι εξέτασε η έρευνα σε ζώα

Αναζητήστε το κυανό του μεθυλενίου για την πολλαπλή σκλήρυνση (ΠΣ) και θα βρείτε δημοσιεύσεις που μοιάζουν να απαντούν στο ίδιο ερώτημα. Δεν το κάνουν. Η μία δημοσίευση χορήγησε κυανό του μεθυλενίου σε ποντίκια με νόσο ως θεραπεία. Η άλλη δεν το χορήγησε ποτέ ως θεραπεία σε κανένα ζώο. Το χρησιμοποίησε ως μπλε χρωστική σε λεπτές τομές νωτιαίου μυελού, ώστε ένας παθολογοανατόμος να μπορεί να δει τη μυελίνη στο μικροσκόπιο.

Αυτή είναι η βασική ιδέα ολόκληρου του άρθρου. Η χρωστική έχει δύο ρόλους στη βιολογία, που δεν έχουν τίποτε κοινό πέρα από το μπουκάλι. Ως υποψήφιο φάρμακο χορηγείται σε ένα ζωντανό ζώο και το ερώτημα είναι αν αλλάζει η νόσος. Ως χρωστική εφαρμόζεται σε νεκρό, μονιμοποιημένο ιστό μετά το πείραμα και το ερώτημα είναι ποια ήταν η εικόνα του ιστού. Αν παραβλέψετε αυτή τη διάκριση, θα διαβάσετε μια ενότητα παθολογοανατομικών μεθόδων σαν να ήταν αποτέλεσμα θεραπείας.

Τι είναι η EAE, με απλά λόγια

Η πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα, που συνήθως συντομογραφείται ως EAE, είναι το καθιερωμένο ζωικό μοντέλο για ορισμένες πτυχές της πολλαπλής σκλήρυνσης. Ένας ερευνητής ανοσοποιεί ένα ευαίσθητο ποντίκι με ένα τμήμα πρωτεΐνης της μυελίνης μαζί με ένα ισχυρό ανοσοενισχυτικό. Στη συνέχεια, το ανοσοποιητικό σύστημα επιτίθεται στο κεντρικό νευρικό σύστημα του ίδιου του ζώου. Το ποντίκι εμφανίζει ανιούσα αδυναμία, η οποία βαθμολογείται εύκολα σε κλίμακα από 0 έως 5, από χαλαρή ουρά έως παράλυση των οπίσθιων άκρων.

Αυτή η ευκολία βαθμολόγησης εξηγεί γιατί η EAE είναι δημοφιλής αλλά και γιατί μπορεί να παραπλανήσει. Η ανθρώπινη ΠΣ εμφανίζεται αυθόρμητα, περιλαμβάνει ένα ευρύτερο και λιγότερο σαφώς καθορισμένο σύνολο στόχων και προκαλεί οπτικά, αισθητικά, γνωστικά, παρεγκεφαλιδικά και κινητικά συμπτώματα, με υποτροπιάζουσα ή προοδευτική πορεία. Η EAE αναπαράγει επιλεγμένους μηχανισμούς, όπως η φλεγμονή, η απομυελίνωση και η βλάβη των αξόνων, υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Δεν αναπαράγει την ΠΣ σε μικρογραφία. Οι αναγνώστες που θέλουν το γενικό πλαίσιο μπορούν να εξετάσουν πώς θεωρείται ότι δρα το κυανό του μεθυλενίου σε κυτταρικό επίπεδο πριν αξιολογήσουν οποιονδήποτε μεμονωμένο ισχυρισμό για μια νόσο.

Οι δύο παρακάτω δημοσιεύσεις χρησιμοποίησαν επίσης διαφορετικά αντιγόνα για την EAE, κάτι που έχει σημασία. Η θεραπευτική μελέτη προκάλεσε τη νόσο με MOG35-55, ένα μικρό πεπτίδιο από τη γλυκοπρωτεΐνη μυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων. Η παθολογοανατομική μελέτη προκάλεσε τη νόσο με MP4, μια πρωτεΐνη σύντηξης τμημάτων της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης και της πρωτεολιπιδικής πρωτεΐνης. Η επιλογή στελέχους και αντιγόνου αλλάζει το πού εμφανίζονται οι βλάβες και πώς συμπεριφέρεται η φλεγμονή, επομένως οι δύο μελέτες δεν αποτελούν δύο επαναλήψεις του ίδιου πειράματος.

Ο χάρτης: από το μοντέλο στο ερώτημα και στα όρια

Κρατήστε αυτόν τον πίνακα ανοιχτό. Είναι ο βασικός πίνακας αναφοράς αυτού του άρθρου. Κάθε γραμμή αναφέρει ποιο κλινικό ερώτημα μπορεί να εξετάσει το μοντέλο, τι μετρήθηκε πραγματικά και πού σταματά η δυνατότητα εφαρμογής των ευρημάτων στον άνθρωπο.

Όποιος ελέγχει τον επόμενο τίτλο μπορεί να χρησιμοποιήσει τις ίδιες στήλες με τη βοήθεια του οδηγού πώς να διαβάζετε προκλινικές μελέτες: να εξετάσει το είδος και το αντιγόνο, τον ρόλο της ένωσης, τα καταληκτικά σημεία και αν το αποτέλεσμα αφορά την πορεία μιας νόσου ή ένα στιγμιότυπο του ιστού.

Το θεραπευτικό αποτέλεσμα: τι άλλαξε η χορήγηση

Η θεραπευτική μελέτη του 2016 στο Journal of Neuroimmunology χρησιμοποίησε θηλυκά ποντίκια C57BL/6, ηλικίας περίπου 8 έως 10 εβδομάδων, τα οποία ανοσοποιήθηκαν με 250 μικρογραμμάρια MOG35-55 ανά ποντίκι. Μετά την πρόκληση της EAE, τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε ομάδα κυανού του μεθυλενίου ή σε ομάδα EAE χωρίς θεραπεία και οι κλινικές βαθμολογίες παρακολουθήθηκαν έως περίπου την ημέρα 30.

Οι κλινικές βαθμολογίες ήταν σημαντικά χαμηλότερες στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία από ό,τι στα ποντίκια ελέγχου με EAE από την ημέρα 15 έως την ημέρα 30, με P μικρότερο από 0.01. Η ανάλυση του νωτιαίου μυελού έδειξε την ίδια κατεύθυνση, με λιγότερη φλεγμονώδη διήθηση, λιγότερη απομυελίνωση και μικρότερη απώλεια αξόνων στα ζώα που έλαβαν θεραπεία.

Το ιδιαίτερο στοιχείο ήταν η ομάδα δεικτών σηματοδότησης. Η θεραπεία αύξησε την ενεργοποίηση της AMPK και την έκφραση της SIRT1 και κατέστειλε την ενεργοποίηση του NF-kB, ενός κεντρικού διακόπτη της φλεγμονής. Στην προσαρμοστική ανοσία, μείωσε την απόκριση Th17 και ενίσχυσε την απόκριση Treg. Η προτεινόμενη αλληλουχία είναι επομένως: κυανό του μεθυλενίου, κατόπιν AMPK και SIRT1, έπειτα χαμηλότερη σηματοδότηση NF-kB, μετατόπιση από τα φλεγμονώδη Th17 προς τα ρυθμιστικά Treg, ηπιότερη ιστική βλάβη και χαμηλότερες βαθμολογίες.

Αυτή η αλληλουχία αποτελεί ερμηνεία, όχι αποδεδειγμένη αιτιώδη ακολουθία. Η μελέτη δείχνει ότι το φάρμακο, οι αλλαγές στη σηματοδότηση και η βελτίωση της νόσου συμβαδίζουν. Δεν αποδεικνύει ότι η AMPK και η SIRT1 εξηγούν ολόκληρο το όφελος, ενώ το δημόσια ευρετηριασμένο κείμενο δεν παρουσιάζει την ακριβή δόση σε χιλιοστόγραμμα ανά χιλιόγραμμο, την οδό χορήγησης, την ημέρα έναρξης ή τη διάρκεια με αρκετή σαφήνεια ώστε να αναπαραχθεί το σχήμα μόνο από την περίληψη. Θεωρήστε ανεπιβεβαίωτο οποιονδήποτε αριθμό δοσολογίας αναφέρεται για αυτή τη δημοσίευση σε μια σελίδα πωλήσεων, εκτός αν παραπέμπει στις μεθόδους του πλήρους κειμένου. Στο ευρύτερο σύνολο στοιχείων από μελέτες σε ανθρώπους για το κυανό του μεθυλενίου μπορεί κανείς να ελέγξει αν αυτό το πρώιμο ανοσολογικό εύρημα εξελίχθηκε ποτέ σε κλινικά δεδομένα.

Το παθολογοανατομικό αποτέλεσμα: τι έδειξε ο ιστός σε έξι μήνες

Η μελέτη MP4 του 2015 στο PLoS ONE χρησιμοποίησε θηλυκά ποντίκια C57BL/6 που ανοσοποιήθηκαν με 200 μικρογραμμάρια MP4 σε πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund, μαζί με τοξίνη κοκκύτη την ημέρα της ανοσοποίησης και ξανά 48 ώρες αργότερα. Κανένα ζώο δεν έλαβε κυανό του μεθυλενίου ως φάρμακο. Μετά τη μονιμοποίηση και την έγκλειση, εγκάρσιες τομές νωτιαίου μυελού πάχους ενός μικρομέτρου χρώστηκαν με κυανό του μεθυλενίου για οπτική μικροσκοπία, ενώ χρησιμοποιήθηκε ηλεκτρονική μικροσκοπία της προσθιοπλάγιας δεσμίδας για λεπτομερέστερη εξέταση.

Έγινε δειγματοληψία ιστού σε τρία στάδια: στην κορύφωση της οξείας φάσης με 7 ποντίκια, τρεις μήνες μετά την έναρξη με 5 ποντίκια και έξι μήνες μετά την έναρξη με 10 ποντίκια. Οι μέσες κλινικές βαθμολογίες σε αυτά τα στάδια ήταν σχεδόν πανομοιότυπες, περίπου 1.7 έως 1.8 στην κλίμακα 0 έως 5. Ο ιστός έδειξε μια διαφορετική εικόνα. Οι ίνες με μεμονωμένη βλάβη μυελίνης αυξήθηκαν από περίπου 569,000 ανά τετραγωνικό χιλιοστό στην κορύφωση της οξείας φάσης σε περίπου 1,496,000 στους έξι μήνες, με στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ οξείας και μακροχρόνιας φάσης και P ίσο με 0.027. Η συνδυασμένη βλάβη μυελίνης και αξόνων σχεδόν διπλασιάστηκε έως τους έξι μήνες. Οι ίνες σε επαναμυελίνωση παρέμειναν κάτω από το ένα τοις εκατό σε κάθε στάδιο, μια λεπτομέρεια που μετριάζει τις ελπίδες αποκατάστασης.

Η βλάβη των αξόνων ακολούθησε μοτίβο σχήματος U: υψηλή στην κορύφωση της οξείας φάσης, χαμηλότερη στους τρεις μήνες και υψηλότερη στους έξι μήνες. Συσχετίστηκε με διόγκωση των μιτοχονδρίων και με μειωμένες αποστάσεις μεταξύ των νευροϊνιδίων. Η αξιολόγηση έγινε χωρίς γνώση της βαθμολογίας και του σταδίου, γεγονός που ενισχύει την ερμηνεία ότι οι κλινικές βαθμολογίες υποεκτιμούσαν τη συνεχιζόμενη δομική βλάβη.

Αυτή η αναντιστοιχία είναι η πραγματική συμβολή της μελέτης για έναν αναγνώστη που ενδιαφέρεται για την ΠΣ. Μια σταθερή βαθμολογία αναπηρίας δεν σήμαινε σταθερή κατάσταση του ιστού. Δείχνει επίσης γιατί αυτή η δημοσίευση δεν μπορεί να στηρίξει κανέναν ισχυρισμό για θεραπεία της ΠΣ με κυανό του μεθυλενίου. Εξέτασε τον χρόνο, όχι τη θεραπεία.

Γιατί καμία από τις δύο μελέτες δεν τεκμηριώνει όφελος σε ασθενείς

Σκεφτείτε ότι κάθε δημοσίευση απαντά καλά σε ένα περιορισμένο ερώτημα, αλλά δεν απαντά καθόλου στο ερώτημα που αφορά τους ασθενείς.

Πρώτον, διαφέρει η αιτία. Η EAE προκαλείται σκόπιμα με ένα καθορισμένο αντιγόνο και ανοσοενισχυτικό. Η ανθρώπινη ΠΣ αναπτύσσεται αυθόρμητα, με ένα ευρύτερο ανοσολογικό ρεπερτόριο που περιλαμβάνει Τ κύτταρα, Β κύτταρα, έμφυτη ανοσία και γλοιακά κύτταρα που εδρεύουν στον ιστό. Μια ένωση που μεταβάλλει μια απόκριση προσανατολισμένη στο MOG σε ένα ποντίκι δεν είναι απαραίτητο να μεταβάλλει αυτή την ευρύτερη ανθρώπινη απόκριση.

Δεύτερον, διαφέρει ο φαινότυπος. Η ανιούσα αδυναμία από την ουρά προς τα οπίσθια άκρα σε ένα ποντίκι είναι ένας εύχρηστος δείκτης. Συμπυκνώνει την ετερογένεια της ανθρώπινης ΠΣ σε έναν μόνο αριθμό κινητικής λειτουργίας. Συχνά τα φάρμακα μεταβάλλουν τις βραχυπρόθεσμες βαθμολογίες EAE χωρίς να αλλάζουν την πορεία της νόσου στον άνθρωπο, γι’ αυτό η EAE είναι εργαλείο διαλογής υποψήφιων θεραπειών και μελέτης μηχανισμών, όχι μια κλινική σε μικρογραφία.

Τρίτον, η έκθεση και ο χρονισμός παραμένουν αδιευκρίνιστα. Η συνεχής χορήγηση από πρώιμο στάδιο σε ένα πείραμα 30 ημερών σε ποντίκια δεν ισοδυναμεί με χρόνια από του στόματος χρήση σε ένα άτομο με εγκατεστημένη νόσο, ενώ καμία από τις δύο μελέτες δεν μέτρησε τα επίπεδα του φαρμάκου στο νευρικό σύστημα. Χωρίς αυτόν τον σύνδεσμο δεν υπάρχει γέφυρα από μια συγκέντρωση σε πλάκα εργαστηρίου ή μια δόση σε ποντίκι προς ένα θεραπευτικό σχήμα για ανθρώπους.

Τέταρτον, οι δύο δημοσιεύσεις δεν αναπαράγουν η μία τα ευρήματα της άλλης. Διαφορετικά αντιγόνα, διαφορετικά ερωτήματα, διαφορετικά καταληκτικά σημεία και, στη μία περίπτωση, καμία θεραπεία. Η από κοινού αναφορά τους ως δύο θετικών θεραπευτικών μελετών για την ΠΣ αποτελεί σφάλμα κατηγοριοποίησης.

Τι σημαίνει αυτό για τους αναγνώστες που σταθμίζουν τα στοιχεία

Δεν υπάρχει καθιερωμένο πρωτόκολλο κυανού του μεθυλενίου για την ΠΣ σε αυτές τις δημοσιεύσεις. Η θεραπευτική μελέτη στηρίζει την περαιτέρω έρευνα για την AMPK, τη SIRT1, το NF-kB και την ισορροπία Th17 προς Treg στη MOG EAE. Η παθολογοανατομική μελέτη υπενθυμίζει ότι η ιστική βλάβη μπορεί να εξελίσσεται ενώ οι βαθμολογίες φαίνονται σταθερές και ότι το κυανό του μεθυλενίου σε μια ενότητα μεθόδων μερικές φορές παραπέμπει σε δοχείο χρωστικής και όχι σε φαρμακείο. Οι αναγνώστες που παρακολουθούν τη συνεχιζόμενη έρευνα για την πολλαπλή σκλήρυνση θα πρέπει να έχουν κατά νου αυτή τη διάκριση μεταξύ χρωστικής και φαρμάκου. Τα ερωτήματα ασφάλειας, συμπεριλαμβανομένων των κινδύνων που αφορούν το αίμα και τις αλληλεπιδράσεις, πρέπει να συζητούνται με κλινικό ιατρό, μαζί με τα γενικά δεδομένα ασφάλειας του κυανού του μεθυλενίου, πριν ενεργήσει κανείς με βάση τίτλους εργαστηριακών ερευνών.

Το συμπέρασμα χωρά σε μία πρόταση. Η μία αναφερόμενη μελέτη χορήγησε κυανό του μεθυλενίου σε ποντίκια με MOG EAE και ανέφερε ηπιότερη νόσο με αντιφλεγμονώδη μετατόπιση της ανοσολογικής απόκρισης, ενώ η άλλη αναφερόμενη μελέτη δεν χορήγησε καμία θεραπεία και χρησιμοποίησε το κυανό του μεθυλενίου μόνο για τη χρώση του νωτιαίου μυελού, καταγράφοντας έξι μήνες συσσωρευόμενης βλάβης της μυελίνης και των αξόνων, επομένως οι δύο μαζί δεν τεκμηριώνουν ότι το κυανό του μεθυλενίου βοηθά στην ανθρώπινη ΠΣ.