Μπορεί το κυανό του μεθυλενίου να παρακάμψει το μιτοχονδριακό Σύμπλοκο III; Γιατί οι μελέτες διαφωνούν

Δύο εργαστήρια εξέτασαν αν το κυανό του μεθυλενίου μπορεί να παρακάμψει ένα αποκλεισμένο μιτοχονδριακό Σύμπλοκο III. Το ένα απάντησε όχι. Το άλλο απάντησε ναι. Και τα δύο είχαν δεδομένα.

Η πρώτη μελέτη, σε μιτοχόνδρια εγκεφάλου ποντικού, διαπίστωσε ότι η χρωστική δεν μπορεί να το παρακάμψει. Η δεύτερη, σε μιτοχόνδρια εγκεφάλου από τρία είδη τρωκτικών, διαπίστωσε ότι μπορεί εν μέρει. Μια τρίτη μελέτη, σε ήπαρ ποντικού, αναφέρεται συχνά στο ίδιο πλαίσιο, αλλά εξέτασε κάτι άλλο. Αν την τοποθετήσουμε στο σωστό πλαίσιο, η μισή σύγχυση ξεκαθαρίζει.

Δεν υπάρχει κάποιος καθολικός μηχανισμός προς ανακοίνωση. Υπάρχουν τρία πειράματα με διαφορετικούς αναστολείς, δόσεις και μετρούμενες παραμέτρους. Διαβάστε πρώτα τις συνθήκες. Τα συμπεράσματα ακολουθούν.

Τι σημαίνει εδώ η παράκαμψη

Τα ηλεκτρόνια εισέρχονται στην αλυσίδα μέσω του Συμπλόκου I (από το NADH) ή του Συμπλόκου II (από το ηλεκτρικό), περνούν μέσω του Συμπλόκου III στο κυτόχρωμα c και στη συνέχεια μέσω του Συμπλόκου IV στο οξυγόνο. Η βαθμίδα που δημιουργείται στην πορεία είναι αυτή που αξιοποιεί το κύτταρο για να παράγει ATP.

Ο ισχυρισμός περί παράκαμψης σημαίνει ότι το κυανό του μεθυλενίου παραλαμβάνει ηλεκτρόνια πριν από ένα σημείο αποκλεισμού και τα παραδίδει μετά από αυτό. Η οξειδωμένη χρωστική δέχεται ηλεκτρόνια από το NADH ή από πρώιμα συστατικά της αλυσίδας, μετατρέπεται σε λευκοκυανό του μεθυλενίου και η ανηγμένη μορφή τα μεταφέρει στο κυτόχρωμα c ή τα επιστρέφει στην αλυσίδα. Αν η μεταφορά καταλήξει μετά από το σημείο αποκλεισμού, η αναπνοή και το δυναμικό της μεμβράνης αποκαθίστανται εν μέρει. Αν καταλήξει στο σημείο αποκλεισμού ή πριν από αυτό, δεν αποκαθίσταται τίποτα.

Μια λεπτομέρεια του Συμπλόκου III καθορίζει μεγάλο μέρος αυτής της διαφωνίας. Το σύμπλοκο λειτουργεί με έναν κύκλο Q που περιλαμβάνει δύο θέσεις δέσμευσης αναστολέων. Η αντιμυκίνη δεσμεύεται στη θέση Qi. Η μυξοθειαζόλη δεσμεύεται στη θέση Qo. Μια μελέτη που χρησιμοποιεί μόνο έναν από αυτούς έχει εξετάσει μόνο το μισό σύμπλοκο.

Πρώτη μελέτη: καμία παράκαμψη σε μιτοχόνδρια εγκεφάλου ποντικού

Ο Gureev και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν μιτοχόνδρια του εγκεφαλικού φλοιού ποντικών C57BL/6, απομονωμένα με διγιτονίνη, και τα εξέτασαν σε συγκέντρωση 0.1 mg πρωτεΐνης ανά ml. Τα υποστρώματα κάλυπταν τρία σχήματα: πυροσταφυλικό μαζί με μηλικό στα 5 mM το καθένα, ηλεκτρικό στα 10 mM με γλουταμινικό στα 2 mM και L-προλίνη στα 10 mM. Οι αναστολείς ήταν ροτενόνη σε συγκέντρωση 1 micromolar (Σύμπλοκο I) και αντιμυκίνη σε συγκέντρωση 1 microgram ανά ml (Σύμπλοκο III). Οι δόσεις της χρωστικής ήταν 0.5, 1 και 2 micromolar, με κύρια συγκέντρωση το 1 micromolar. Οι μέθοδοι και οι καταγραφές βρίσκονται στη δημοσίευση του FEBS Letters.

Η παράκαμψη του Συμπλόκου I λειτούργησε. Η ροτενόνη μείωσε την αναπνοή που διεγείρεται από το ADP από περίπου 121 σε περίπου 2 nmol ανά λεπτό ανά mg, και η χρωστική σε συγκέντρωση 1 micromolar την επανέφερε σε περίπου 21. Το δυναμικό της μεμβράνης αποκαταστάθηκε με πυροσταφυλικό μαζί με μηλικό και με L-προλίνη.

Η παράκαμψη του Συμπλόκου III δεν λειτούργησε. Η αντιμυκίνη μείωσε την αναπνοή σε περίπου 16 και η χρωστική την αύξησε μόνο σε περίπου 20. Το δυναμικό της μεμβράνης δεν αποκαταστάθηκε με κανένα υπόστρωμα, ακόμη και με δόσεις χρωστικής έως 5 micromolar. Τα δεδομένα για το υπεροξείδιο έδειχναν το ίδιο: η χρωστική μόνη της αύξησε την έκλυση υπεροξειδίου από έναν βασικό ρυθμό κοντά στα 76 pmol ανά λεπτό ανά mg σε περίπου 1170, 1460 και 1945 στις τρεις δόσεις, όμως η αντιμυκίνη μείωσε αυτό το σήμα που προκαλούσε η χρωστική κατά περίπου 25, 88 και 96 τοις εκατό αντίστοιχα. Αν η ανηγμένη χρωστική αντιδρούσε απευθείας με το οξυγόνο, ο αποκλεισμός του Συμπλόκου III δεν θα έπρεπε να καταστέλλει το σήμα. Οι συγγραφείς συμπέραναν ότι η ανηγμένη χρωστική οξειδώνεται στη θέση Qo του Συμπλόκου III, πριν από το σημείο αποκλεισμού της αντιμυκίνης. Ο σύντομος βρόχος, με λόγια: από τους δότες στη χρωστική, από τη χρωστική στη θέση Qo και έπειτα μέσω της κανονικής διαδρομής. Η ροτενόνη παρακάμπτεται. Η αντιμυκίνη όχι.

Δεύτερη μελέτη: μερική παράκαμψη σε τρία είδη, και στις δύο θέσεις αναστολής

Ο Svab και οι συνεργάτες του διεύρυναν τον πειραματικό σχεδιασμό. Χρησιμοποίησαν μιτοχόνδρια εγκεφάλου από ποντικούς, αρουραίους και ινδικά χοιρίδια, απομονωμένα με Percoll, και τα εξέτασαν στην ίδια συγκέντρωση των 0.1 mg ανά ml, με πυροσταφυλικό μαζί με μηλικό ή γλουταμινικό μαζί με μηλικό στα 5 mM το καθένα. Χρησιμοποίησαν δύο αναστολείς του Συμπλόκου III: αντιμυκίνη A στα 0.3 micromolar και μυξοθειαζόλη στο 1 micromolar. Η χρωστική ήταν στα 2 micromolar στις περισσότερες δοκιμασίες και στα 0.5 στις δοκιμασίες με κυτόχρωμα c. Και τα τρία είδη, με αντίστοιχα πρωτόκολλα, περιλαμβάνονται στο άρθρο ανοικτής πρόσβασης.

Και οι δύο αποκλεισμοί παρακάμφθηκαν εν μέρει, και στα τρία είδη. Στα μιτοχόνδρια ποντικού, η αντιμυκίνη κατέστειλε την αναπνοή και η χρωστική την αύξησε κατά περίπου 60 τοις εκατό, από περίπου 37 σε 59 nmol ανά λεπτό ανά mg. Η μυξοθειαζόλη την κατέστειλε κατά 88 τοις εκατό, σε περίπου 4.5, και η χρωστική την αύξησε στο πενταπλάσιο, σε περίπου 23. Το δυναμικό της μεμβράνης επαναπολώθηκε εν μέρει με καθέναν από τους δύο αναστολείς. Μετρήθηκε με δύο χρωστικές (σαφρανίνη O και TMRM με μέτρηση λόγου σημάτων), ώστε να αποκλειστούν οπτικά τεχνουργήματα.

Αυτό το άρθρο εξέτασε επίσης απευθείας τη μεταφορά ηλεκτρονίων, κάτι που η πρώτη μελέτη δεν έκανε ποτέ. Το εξωγενές ακετυλιωμένο κυτόχρωμα c σε συγκέντρωση 25 micromolar δεν αναγόταν από ενεργειακά φορτισμένα μιτοχόνδρια, είτε υπήρχαν αναστολείς είτε όχι, αλλά η προσθήκη χρωστικής προκάλεσε αναγωγή και στις δύο περιπτώσεις. Σε ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς κύτταρα, το NADH μαζί με τη χρωστική ανήγαγε το κυτόχρωμα c με ρυθμό ανάλογο προς το NADH. Το μεγαλύτερο άλμα, με λόγια: από τα αναγωγικά ισοδύναμα στη χρωστική, από τη χρωστική απευθείας στο κυτόχρωμα c και μέσω του Συμπλόκου IV στο οξυγόνο. Αυτή η διαδρομή παρακάμπτει εξ ολοκλήρου το Σύμπλοκο III, επομένως μπορούν να παρακαμφθούν και οι δύο αναστολείς.

Δύο επιπλέον μετρήσεις υποστηρίζουν αυτή την ερμηνεία. Ο φθορισμός του NAD(P)H μειώθηκε όταν προστέθηκε χρωστική σε μιτοχόνδρια που είχαν υποστεί επεξεργασία με μυξοθειαζόλη, κάτι που σημαίνει ότι τα αναγωγικά ισοδύναμα διοχετεύονταν μέσω της νέας διαδρομής. Επίσης, η απορρόφηση της χρωστικής στα 660 nm ακολουθούσε κάθε διαδοχική προσθήκη, ενώ τα υπερκείμενα μετά τη φυγοκέντρηση έδειχναν ότι η οξειδωμένη χρωστική συσσωρευόταν μέσα στα ενεργειακά φορτισμένα μιτοχόνδρια σε συγκέντρωση πάνω από εκατονταπλάσια και στη συνέχεια απομακρυνόταν όταν κατέρρεε το δυναμικό. Το ισοζύγιο πρωτονίων συμφωνεί επίσης: η παράκαμψη των σταδίων άντλησης αφήνει περίπου 2 πρωτόνια ανά ζεύγος ηλεκτρονίων αντί για 10. Επομένως, η ταχύτερη κατανάλωση οξυγόνου με μόνο μερική επαναπόλωση είναι αυτό που αναμένεται από μια πραγματική παράκαμψη, όχι ένδειξη εναντίον της.

Το ίδιο παρασκεύασμα έδωσε αποκρίσεις που δεν επιτρέπουν επιπόλαιη ανάγνωση. Με αναστολέα και χρωστική, το ADP μείωσε την αναπνοή αντί να την αυξήσει, και ο αποκλεισμός της μεταφοράς την διέγειρε αντί να την επιβραδύνει, ενώ το δυναμικό της μεμβράνης εξακολουθούσε να μεταβάλλεται προς τις συνήθεις κατευθύνσεις. Η κατανάλωση οξυγόνου από μόνη της παραπλανά σε αυτό το σύστημα.

Τρίτη μελέτη: η μελέτη στο ήπαρ που εξέτασε τα Σύμπλοκα I και II, όχι το III

Οι Lee και Boelsterli χρησιμοποίησαν μιτοχόνδρια ήπατος ποντικού και καλλιεργημένα ηπατοκύτταρα που είχαν υποστεί βλάβη από εφαβιρένζη (Σύμπλοκο I, IC50 κοντά στα 30 micromolar) και υδραζίνη, τον μεταβολίτη της ισονιαζίδης (Σύμπλοκο II, IC50 κοντά στα 30 micromolar). Η χρωστική σε συγκέντρωση περίπου 30 micromolar αποκατέστησε την οξείδωση του NADH, το δυναμικό της μεμβράνης και το ATP, μειώνοντας παράλληλα τους οξειδωτικούς παράγοντες και τον νεκρωτικό θάνατο. Το άρθρο του Redox Biology παρουσιάζει ένα μοντέλο στο οποίο η χρωστική μεταφέρει ηλεκτρόνια παρακάμπτοντας τα Σύμπλοκα I και II που έχουν υποστεί βλάβη.

Αυτό το αποτέλεσμα αποτελεί τεκμηριωμένο πλαίσιο για τα προηγούμενα στάδια της αλυσίδας και δεν λέει τίποτα για το Σύμπλοκο III, επειδή κανένα στοιχείο του δεν είχε αποκλειστεί. Δεν μπορεί να επιβεβαιώσει ή να αντικρούσει καμία από τις δύο μελέτες στον εγκέφαλο.

Ο πίνακας των συνθηκών

Τέσσερις λόγοι για τους οποίους και οι δύο μελέτες του Συμπλόκου III μπορεί να είναι σωστές για τη δική τους πειραματική διάταξη

1. Ο αναστολέας δεν αποτελούσε την ίδια παρέμβαση. Αντιμυκίνη μόνη της στο 1 microgram ανά ml, έναντι αντιμυκίνης στα 0.3 micromolar και ενός ξεχωριστού αναστολέα της θέσης Qo. Μια διαδρομή της χρωστικής που τροφοδοτεί τη θέση Qo αποτυγχάνει ακριβώς εκεί όπου μια διαδρομή απευθείας προς το κυτόχρωμα c επιτυγχάνει. Η μία θέση δεν μπορεί να αντιπροσωπεύει και τις δύο.

2. Η δόση της χρωστικής και ο χρονισμός διέφεραν. Κύριες συγκεντρώσεις 1 έναντι 2 micromolar, για μια ουσία που συμμετέχει σε κύκλους οξειδοαναγωγής και της οποίας η πρόσληψη και η απευθείας αναγωγή του κυτοχρώματος c εξαρτώνται από τη συγκέντρωση και τον χρόνο. Μικρές διαφορές στη δόση μαζί με διαφορετικό χρονισμό των μετρήσεων μπορούν να αναδείξουν διαφορετικούς κλάδους του ίδιου δικτύου.

3. Τα παρασκευάσματα διέφεραν. Η απομόνωση με διγιτονίνη έναντι της απομόνωσης με βαθμίδωση Percoll επιλέγει επικαλυπτόμενους, αλλά όχι ταυτόσημους μιτοχονδριακούς πληθυσμούς. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης ήταν ίδια, στα 0.1 mg ανά ml, επομένως αυτή η μεταβλητή αποκλείεται, όχι όμως ο υποπληθυσμός και η ακεραιότητα. Και η διαφορά είδους έπαψε να θεωρείται ύποπτη: η δεύτερη ομάδα αναπαρήγαγε τον φαινότυπό της και σε ποντικό.

4. Η κατάσταση των υποστρωμάτων καθορίζει τι μπορεί να κάνει η χρωστική. Τρία σχήματα υποστρωμάτων έναντι ζευγών συνδεδεμένων με το NADH. Η διαθεσιμότητα NADH και το δυναμικό της μεμβράνης καθορίζουν από κοινού πόσο γρήγορα ανάγεται η χρωστική και πού κατανέμεται. Μια διαδρομή που χρειάζεται ανηγμένη χρωστική δίπλα σε οξειδωμένο κυτόχρωμα c εξαρτάται καθοριστικά από αυτή την επιλογή.

Πώς να διαβάσετε τον επόμενο ισχυρισμό περί παράκαμψης

Ρωτήστε ποιο σύμπλοκο αποκλείστηκε, με ποιον αναστολέα, σε ποια θέση και σε ποια δόση. Ρωτήστε τη συγκέντρωση της χρωστικής και πότε έγινε η μέτρηση. Ρωτήστε για τον ιστό, το είδος, την απομόνωση, τη συγκέντρωση πρωτεΐνης και το υπόστρωμα. Και ρωτήστε αν συμφωνούν το δυναμικό, η αναπνοή, η οξειδοαναγωγική κατάσταση και μια δοκιμασία απευθείας μεταφοράς ηλεκτρονίων, επειδή εδώ η κατανάλωση οξυγόνου από μόνη της οδήγησε σε λάθος κατεύθυνση περισσότερες από μία φορές.

Η στενά οριοθετημένη σύνοψη παραμένει έγκυρη. Για την παράκαμψη του Συμπλόκου I μέσω της χρωστικής υπάρχει συμφωνία. Για το Σύμπλοκο III, τα μιτοχόνδρια ποντικού με αντιμυκίνη στο 1 microgram ανά ml και χρωστική στο 1 micromolar δεν δείχνουν λειτουργική παράκαμψη, ενώ τρία είδη με αντιμυκίνη στα 0.3 micromolar ή μυξοθειαζόλη στο 1 micromolar και χρωστική στα 2 micromolar δείχνουν μερική παράκαμψη με απευθείας μεταφορά από τη χρωστική στο κυτόχρωμα c. Αυτές οι προτάσεις μπορούν να συνυπάρχουν. Οτιδήποτε ευρύτερο είναι προέκταση πέρα από τα δεδομένα.

Η σχετική ανάγνωση κρατά τον αμφισβητούμενο ισχυρισμό μέσα στο πλαίσιο της αδιαμφισβήτητης χημείας: πώς το κυανό του μεθυλενίου μεταφέρει ηλεκτρόνια για τη διαδοχική μεταφορά, τα πειράματα παράκαμψης του Συμπλόκου I για την τεκμηριωμένη περίπτωση στα προηγούμενα στάδια της αλυσίδας, οι μετρήσεις του δυναμικού της μεμβράνης και τα τεχνουργήματά τους για το γιατί χρειάστηκαν δύο χρωστικές, και ο εργαστηριακός χειρισμός ουσιών που συμμετέχουν σε κύκλους οξειδοαναγωγής για τις παγίδες της δοσολογίας και του χρονισμού.