Κυανό του μεθυλενίου και όραση: τι δείχνει η έρευνα στον αμφιβληστροειδή και πού σταματά

Ένας αναγνώστης βρίσκει μια μελέτη στην οποία το κυανό του μεθυλενίου προστάτευσε τον αμφιβληστροειδή και θέτει το εύλογο ερώτημα: πρέπει να μπει στο μάτι; Η έρευνα για το κυανό του μεθυλενίου και την όραση δεν απαντά σε αυτό το ερώτημα, επειδή καμία από τις βασικές μελέτες δεν εξέτασε αυτή τη χρήση. Στη μία, η χρωστική εγχύθηκε στο υαλοειδές σώμα ποντικών μαζί με μια τοξίνη. Στην άλλη, προστέθηκε στο θρεπτικό μέσο που περιέβαλλε απομονωμένα κύτταρα σε τρυβλίο. Στην τρίτη, προστέθηκε στο πόσιμο νερό μεταλλαγμένων ποντικών. Κάθε αποτέλεσμα αφορά τη συγκεκριμένη οδό χορήγησης και το συγκεκριμένο μοντέλο.

Αυτό το άρθρο εξετάζει τρεις προκλινικές μελέτες, δύο τύπους κυττάρων του αμφιβληστροειδούς και το όριο ανάμεσα στην εργαστηριακή προστασία και την κλινική θεραπεία των ματιών. Το μοτίβο είναι σταθερό: το κυανό του μεθυλενίου μπορεί να τροποποιήσει το μιτοχονδριακό στρες στα κύτταρα του αμφιβληστροειδούς υπό ελεγχόμενες συνθήκες, αλλά αυτό το εύρημα δεν δικαιολογεί την εφαρμογή διαλυμάτων λιανικής πώλησης στο μάτι.

Δύο τύποι κυττάρων, δύο διαφορετικές παθήσεις

Ο αμφιβληστροειδής αποτελείται από στιβάδες, και η συγκεκριμένη στιβάδα έχει σημασία. Το φως προσπίπτει πρώτα στους φωτοϋποδοχείς του εξωτερικού αμφιβληστροειδούς. Τα σήματά τους περνούν μέσω ενδιάμεσων νευρώνων στα γαγγλιακά κύτταρα του εσωτερικού αμφιβληστροειδούς, των οποίων οι άξονες εξέρχονται μέσω του οπτικού νεύρου. Το παρακάτω διάγραμμα ονομάζει τις στιβάδες με τη σειρά.

Τα γαγγλιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς είναι τα κύτταρα που απειλούνται στο γλαύκωμα και στην οπτική νευροπάθεια. Όταν οι αναζητήσεις αναφέρουν το κυανό του μεθυλενίου και το γλαύκωμα, συνήθως αφορούν αυτή την εσωτερική στιβάδα και τους άξονές της. Οι φωτοϋποδοχείς είναι τα κύτταρα που απειλούνται στον εκφυλισμό του εξωτερικού αμφιβληστροειδούς. Έχουν τις υψηλότερες ενεργειακές απαιτήσεις στον αμφιβληστροειδή και λειτουργούν κοντά στο όριο της κυτταρικής τους αναπνοής, γεγονός που τους αφήνει μικρό περιθώριο εφεδρείας όταν το μιτοχονδριακό σύμπλοκο I δυσλειτουργεί. Ένα αποτέλεσμα σε έναν τύπο κυττάρων δεν μεταφέρεται στον άλλο, και οι τρεις μελέτες που ακολουθούν τους εξετάζουν χωριστά. Η γενική δεξιότητα της διάκρισης των μοντέλων από τα συμπεράσματα εξηγείται στο άρθρο πώς να διαβάζετε την έρευνα για το κυανό του μεθυλενίου.

Γαγγλιακά κύτταρα στο μάτι ζωντανού ποντικού

Στην παλαιότερη από τις τρεις μελέτες, οι ερευνητές δημιούργησαν ένα μοντέλο οπτικής νευροπάθειας με μικροέγχυση ροτενόνης στο υαλοειδές σώμα του ενός ματιού ποντικού, χρησιμοποιώντας το άλλο μάτι ως μάρτυρα με χορήγηση μόνο του διαλύτη. Η ροτενόνη αναστέλλει το μιτοχονδριακό σύμπλοκο I, το σημείο εισόδου που μεταφέρει ηλεκτρόνια από το NADH προς τα επόμενα στάδια. Η δυσλειτουργία του συμπλόκου I είναι επίσης το χαρακτηριστικό που συνδέει αυτό το μοντέλο με την κληρονομική οπτική νευροπάθεια Leber, μια πάθηση των γαγγλιακών κυττάρων και του οπτικού νεύρου.

Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, η στιβάδα των γαγγλιακών κυττάρων στα μάτια που είχαν λάβει ροτενόνη ήταν λεπτότερη και περιείχε λιγότερα κύτταρα από τα μάτια ελέγχου. Όταν το κυανό του μεθυλενίου συγχορηγήθηκε με έγχυση μαζί με τη ροτενόνη, η βλάβη αποτράπηκε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, με την υψηλότερη δόση που εξετάστηκε (0.07 mg/kg, πολύ κάτω από την LD50 στους ποντικούς) να διατηρεί τόσο το πάχος όσο και τον αριθμό των κυττάρων. Παράλληλες δοκιμές σε ομογενοποιήματα εγκεφάλου έδειξαν δύο επιδράσεις: το κυανό του μεθυλενίου ανέστρεψε το οξειδωτικό στρες που προκάλεσε η ροτενόνη και ανέστρεψε τη μείωση της κατανάλωσης οξυγόνου. Οι συγγραφείς πρότειναν έναν μηχανισμό διεγερτοτοξικότητας, στον οποίο η ροτενόνη βλάπτει τα αμακρινή κύτταρα που ρυθμίζουν τη νευρωνική δραστηριότητα, τα γαγγλιακά κύτταρα εκφορτίζονται υπερβολικά και η αντιοξειδωτική δράση διακόπτει την επακόλουθη βλάβη. Η προτεινόμενη χημεία πίσω από αυτή την προστασία περιγράφεται αναλυτικά στο άρθρο μιτοχονδριακοί μηχανισμοί του κυανού του μεθυλενίου.

Τρεις περιορισμοί συνοδεύουν αυτό το αποτέλεσμα. Η χρωστική συγχορηγήθηκε με την τοξίνη με έγχυση απευθείας στο μάτι, κάτι που αποτελεί μέθοδο χορήγησης και όχι θεραπευτικό σχήμα. Το χρονικό παράθυρο παρατήρησης ήταν 24 ώρες. Και οι μετρήσεις της οξειδάσης του κυτοχρώματος αυξήθηκαν και στις δύο ομάδες με βλάβη, κάτι που οι συγγραφείς ερμήνευσαν ως υπερδραστηριότητα και όχι ως απόδειξη αποκατάστασης της αναπνοής στον ζωντανό αμφιβληστροειδή.

Γαγγλιακά κύτταρα απομονωμένα σε τρυβλίο

Η δεύτερη μελέτη άφησε το μάτι εντελώς εκτός μοντέλου. Οι ερευνητές απομόνωσαν πρωτογενή γαγγλιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς από νεαρούς αρουραίους και τα εξέθεσαν σε ροτενόνη, στον επαγωγέα απόπτωσης σταυροσπορίνη ή σε 72 ώρες χαμηλού οξυγόνου και στη συνέχεια μέτρησαν την επιβίωση με χρώση ζωντανών/νεκρών κυττάρων. Το κυανό του μεθυλενίου σε συγκεντρώσεις 1 και 10 micromolar στο μέσο καλλιέργειας βελτίωσε την επιβίωση έναντι κάθε βλαπτικού παράγοντα, περίπου κατά 1.5 έως 1.9 φορές ανάλογα με τη συνθήκη. Μια συμπληρωματική δοκιμή έδειξε ότι το κυανό του μεθυλενίου διατήρησε τη δραστικότητα της οξειδάσης του κυτοχρώματος c κατά την έκθεση σε υπεροξείδιο του υδρογόνου.

Πρόκειται για φαρμακολογία απομονωμένων κυττάρων. Η ένωση έφτασε στα κύτταρα με διάχυση μέσω του μέσου καλλιέργειας σε καθορισμένη συγκέντρωση, χωρίς κερατοειδή, δακρυϊκή στιβάδα, φακό, υαλοειδές σώμα, αιμάτωση ή ανοσοποιητικό σύστημα στη διαδρομή. Αυτή η απλότητα είναι ο σκοπός του μοντέλου: δείχνει ότι τα ίδια τα γαγγλιακά κύτταρα μπορούν να προστατευθούν όταν η ένωση φτάνει σε αυτά. Δεν λέει τίποτα για το αν μια σταγόνα στην επιφάνεια του κερατοειδούς θα εξασφάλιζε οποιαδήποτε καθορισμένη συγκέντρωση στον εσωτερικό αμφιβληστροειδή. Συγκεντρώσεις πάνω από 10 micromolar αποφεύχθηκαν λόγω τοξικότητας στα ίδια κύτταρα, μια υπενθύμιση ότι η σχέση δόσης και απόκρισης σε ένα τρυβλίο λειτουργεί και προς τις δύο κατευθύνσεις.

Φωτοϋποδοχείς σε μεταλλαγμένους ποντικούς και σε κυτταρική σειρά

Η τρίτη μελέτη αφορά τον εξωτερικό αμφιβληστροειδή. Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν ποντικούς Harlequin, οι οποίοι έχουν ανεπάρκεια του παράγοντα επαγωγής απόπτωσης που αφήνει το σύμπλοκο I ατελώς συναρμολογημένο, και εξέτασαν τη δομή των φωτοϋποδοχέων, δείκτες των εξωτερικών τμημάτων και τη μιτοχονδριακή ακεραιότητα στην ηλικία των 11 μηνών. Το κυανό του μεθυλενίου χορηγήθηκε συστηματικά στο πόσιμο νερό μετά τον απογαλακτισμό, σε περίπου 10 mg/kg την ημέρα. Οι μεταλλαγμένοι ποντικοί που το έλαβαν διατήρησαν μεγαλύτερο πάχος αμφιβληστροειδούς, περισσότερους δείκτες ροδοψίνης και οψίνης και υγιέστερη μιτοχονδριακή δομή από τους μεταλλαγμένους ποντικούς που δεν το έλαβαν.

Η συμπληρωματική κυτταρική μελέτη χρησιμοποίησε κύτταρα 661W, μια αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά ποντικού που μοιάζει με φωτοϋποδοχείς, τα οποία εκτέθηκαν σε ροτενόνη με ή χωρίς κυανό του μεθυλενίου για 24 ώρες. Η επιβίωση βελτιώθηκε στα 30 micromolar, ενώ χαμηλότερες συγκεντρώσεις επανέφεραν την αναλογία NADH προς NAD+ σε φυσιολογικά επίπεδα και μείωσαν το οξειδωτικό στρες. Η εντυπωσιακή λεπτομέρεια είναι αυτό που δεν έκανε το κυανό του μεθυλενίου: δεν αποκατέστησε το ATP. Η προστασία συνδεόταν με την ανακούφιση του οξειδοαναγωγικού στρες και τον περιορισμό των οδών απόκρισης στο στρες, συμπεριλαμβανομένης της μιτοχονδριακής απόκρισης στις μη αναδιπλωμένες πρωτεΐνες και των δεικτών μιτοφαγίας, και όχι με αποκατάσταση της ενεργειακής παροχής.

Αυτή η διάκριση έχει σημασία για τους ισχυρισμούς σχετικά με το κυανό του μεθυλενίου και τον αμφιβληστροειδή. Μια ένωση μπορεί να κρατήσει ζωντανό έναν φωτοϋποδοχέα που βρίσκεται υπό στρες χωρίς να διορθώνει το ενεργειακό του έλλειμμα, κάτι που περιορίζει οποιαδήποτε θεραπευτική ερμηνεία στο οξειδοαναγωγικό στρες και όχι σε μια γενική αναζωογόνηση.

Οι τρεις μελέτες δίπλα δίπλα

Η παρακάτω σύγκριση προσδιορίζει κάθε μελέτη με βάση το μοντέλο και την οδό χορήγησης, καθώς αυτές οι δύο στήλες καθορίζουν τι μπορεί να στηρίξει το αποτέλεσμα.

Κάθε γραμμή αφορά προκλινική μελέτη. Καμία δεν συμπεριέλαβε ασθενείς, δεν μέτρησε την όραση και δεν εξέτασε οφθαλμικό σκεύασμα.

Γιατί αυτό δεν αποτελεί θεραπεία για το γλαύκωμα

Η αντιμετώπιση του γλαυκώματος μειώνει την ενδοφθάλμια πίεση. Η νευροπροστασία επιδιώκει κάτι διαφορετικό: να κρατήσει ζωντανά τα γαγγλιακά κύτταρα και τους άξονές τους υπό συνθήκες στρες. Οι παραπάνω μελέτες ανήκουν στη δεύτερη προσπάθεια, όχι στην πρώτη. Καμία δεν μείωσε την πίεση και καμία δεν συνέκρινε το κυανό του μεθυλενίου με θεραπεία μείωσης της πίεσης. Γι’ αυτό οι καθιερωμένες προσεγγίσεις για το γλαύκωμα και τον έλεγχο της πίεσης παραμένουν ξεχωριστό ζήτημα από την οξειδοαναγωγική νευροπροστασία, και γι’ αυτό ένα αποτέλεσμα κυτταρικής επιβίωσης δεν μπορεί να ερμηνευθεί ως διάσωση της όρασης.

Οι διαφορές στην οδό χορήγησης ενισχύουν αυτό το σημείο. Μια ενδοϋαλοειδική συγχορήγηση με έγχυση τοποθετεί μια γνωστή ποσότητα δίπλα στον αμφιβληστροειδή τη στιγμή της βλάβης. Η χορήγηση μέσω πόσιμου νερού εκθέτει ολόκληρο το ζώο επί μήνες, με άγνωστη συγκέντρωση στον αμφιβληστροειδή. Το μέσο καλλιέργειας εκθέτει άμεσα τα κύτταρα χωρίς ενδιάμεσους φραγμούς. Καμία από αυτές τις μεθόδους δεν προβλέπει ποιο ποσοστό μιας τοπικά χορηγούμενης δόσης θα διέσχιζε τον κερατοειδή, θα παρέμενε παρά την απομάκρυνσή του από τα δάκρυα, θα περνούσε από τον φακό και το υαλοειδές σώμα και θα έφτανε σε οποιαδήποτε από τις δύο στιβάδες του αμφιβληστροειδούς σε ωφέλιμη συγκέντρωση. Αυτό το πρόβλημα χορήγησης αποτελεί μέρος του ευρύτερου ζητήματος των οδών χορήγησης και της κατανομής του κυανού του μεθυλενίου, όπου κάθε οδός χρειάζεται τις δικές της μετρήσεις συγκέντρωσης.

Οι διαφορές μεταξύ ιστών προσθέτουν ένα δεύτερο εμπόδιο. Μια χρωστική που φτάνει στο πρόσθιο τμήμα του ματιού δεν έχει φτάσει στο οπίσθιο, και μια συγκέντρωση που βοηθά μία στιβάδα μπορεί να βλάπτει κάποια άλλη. Τα διαλύματα λιανικής πώλησης δεν παρασκευάζονται, δεν αποστειρώνονται, δεν ρυθμίζονται ως προς το pH και δεν συντηρούνται ως οφθαλμικά σκευάσματα, ενώ η καθαρότητα, το pH, η ωσμωτικότητα και τα έκδοχα έχουν όλα σημασία για την έκθεση του κερατοειδούς και του εσωτερικού του ματιού. Κανένα από αυτά τα ευρήματα στον αμφιβληστροειδή δεν τεκμηριώνει την τοποθέτηση τέτοιων διαλυμάτων μέσα στο μάτι ή στην επιφάνειά του. Τα ερωτήματα για τα πρότυπα παρασκευής εντάσσονται στην ασφάλεια και στον χειρισμό του κυανού του μεθυλενίου.

Πού σταματούν τα στοιχεία

Συνολικά, οι τρεις δημοσιεύσεις στηρίζουν έναν περιορισμένο ισχυρισμό: υπό ελεγχόμενες συνθήκες, το κυανό του μεθυλενίου μπορεί να ανακουφίσει το μιτοχονδριακό οξειδοαναγωγικό στρες στους νευρώνες του αμφιβληστροειδούς και να διατηρήσει τη δομή τους. Ο ισχυρισμός σταματά εκεί όπου σταματούν αυτές οι συνθήκες. Τα μοντέλα με τοξίνες και γενετικά ελαττώματα του συμπλόκου I δεν είναι γλαύκωμα, drusen ή διαβητική νόσος. Τα σύντομα χρονικά παράθυρα και τα δομικά καταληκτικά σημεία δεν ισοδυναμούν με διατήρηση της όρασης σε βάθος χρόνου. Και μια προστατευτική συγκέντρωση σε ένα διαμέρισμα δεν αποτελεί δόση για κάποιο άλλο.

Μια ισχυρότερη τεκμηρίωση θα απαιτούσε ξεχωριστά στοιχεία: καθορισμένη έκθεση του αμφιβληστροειδούς μετά από μια κλινικά εφαρμόσιμη οδό χορήγησης, λειτουργικά καταληκτικά σημεία όρασης σε ζώα, όφελος ανεξάρτητο από την πίεση σε μοντέλο σχετικό με το γλαύκωμα και, στη συνέχεια, δεδομένα ασφάλειας και αποτελεσματικότητας σε ανθρώπους. Μέχρι να υπάρξουν αυτά, η σχέση κυανού του μεθυλενίου και όρασης παραμένει μια ερευνητική υπόθεση με σαφή όρια: εύλογη μιτοχονδριακή φαρμακολογία στον αμφιβληστροειδή, που έχει καταδειχθεί μόνο σε κύτταρα και ζώα, χωρίς διαδρομή από αυτές τις μελέτες προς τη θεραπεία των ματιών.