Κυανό του μεθυλενίου και φερρόπτωση: σίδηρος, υπεροξείδωση λιπιδίων και κυτταρικός θάνατος

Η φερρόπτωση είναι κυτταρικός θάνατος λόγω βλάβης της μεμβράνης. Τα πολυακόρεστα λίπη των μεμβρανών οξειδώνονται μέσω μιας αλυσιδωτής αντίδρασης, η μεμβράνη χάνει τη λειτουργικότητά της και το κύτταρο πεθαίνει. Ο σίδηρος είναι απαραίτητος για αυτή τη χημική διεργασία. Αυτή η πρόταση συνοψίζει ολόκληρη την έννοια και όλα όσα περιγράφονται σε αυτό το άρθρο εξετάζουν ένα μέρος της.

Το ερώτημα εδώ είναι πιο συγκεκριμένο: πώς επηρεάζει το κυανό του μεθυλενίου αυτή την αλυσίδα σε κυτταρικά πειράματα και τι δείχνει πραγματικά το αποτέλεσμα. Η σύντομη απάντηση είναι ότι, σε δύο εργαστηριακές μελέτες, το κυανό του μεθυλενίου σε συγκεντρώσεις της τάξης των nanomolar μείωσε τη μιτοχονδριακή υπεροξείδωση λιπιδίων και διατήρησε τα κύτταρα ζωντανά μετά από ερεθίσματα που διαφορετικά προκαλούν φερρόπτωση. Η εκτενέστερη απάντηση έχει μεγαλύτερη σημασία, επειδή κάθε κρίκος της αλυσίδας εξετάστηκε με διαφορετική παρέμβαση και κάθε παρέμβαση έχει περιορισμούς.

Η φερρόπτωση σε μία παράγραφο

Ένα φωσφολιπίδιο της μεμβράνης που φέρει μια ουρά πολυακόρεστου λιπαρού οξέος έχει ένα αδύναμο σημείο: άτομα υδρογόνου που αποσπώνται εύκολα. Μόλις μια ρίζα αποσπάσει ένα από αυτά, οξυγόνο προστίθεται στο λιπίδιο, σχηματίζεται μια λιπιδική υπεροξυλική ρίζα και αυτή η ρίζα αποσπά υδρογόνο από το επόμενο λιπίδιο. Η αντίδραση εξαπλώνεται κατά μήκος της μεμβράνης, εκτός αν κάτι τη σταματήσει.

Ο κύριος μηχανισμός αναστολής είναι ένα ένζυμο που ονομάζεται GPX4, το οποίο χρησιμοποιεί γλουταθειόνη για να ανάγει τα λιπιδικά υπεροξείδια σε αβλαβείς λιπιδικές αλκοόλες. Οι εργαστηριακοί επαγωγείς επιτίθενται σε αυτή την άμυνα σε συγκεκριμένα σημεία. Η εραστίνη εμποδίζει την εισαγωγή κυστίνης μέσω του συστήματος xc-minus, στερώντας από το κύτταρο την κυστεΐνη που χρειάζεται για τη σύνθεση γλουταθειόνης. Η σουλφοξιμίνη της βουθειονίνης εμποδίζει άμεσα τη σύνθεση γλουταθειόνης. Το RSL3 αναστέλλει την ίδια την GPX4. Και οι τρεις αφήνουν τα υπεροξείδια να παραμένουν, αλλά δρουν σε διαφορετικά στάδια, επομένως ένα αποτέλεσμα με έναν επαγωγέα δεν γενικεύεται αυτόματα στους άλλους.

Η φερρόπτωση διαφέρει από την απόπτωση ως προς τις ιδιότητες που την ορίζουν. Δεν υπάρχει καταρράκτης κασπασών ούτε αποπτωτικά σωμάτια. Χηλικοί παράγοντες του σιδήρου, όπως η δεφεροξαμίνη, και παράγοντες παγίδευσης ριζών, όπως η φερροστατίνη-1, την καταστέλλουν. Αυτό είναι το πρακτικό κριτήριο που χρησιμοποιούν οι ερευνητές για να χαρακτηρίσουν έναν θάνατο ως φερροπτωτικό και όχι απλώς νεκρωτικό. Το ευρύτερο πλαίσιο των οδών ρυθμιζόμενου κυτταρικού θανάτου δίνει νόημα σε αυτή τη διάκριση, ενώ ο τρόπος με τον οποίο τα κύτταρα διαχειρίζονται τον ευκίνητο σίδηρο εξηγεί γιατί η χηλίωση αποτελεί τόσο καθοριστικό έλεγχο.

Ο ρόλος των μιτοχονδρίων και γιατί αμφισβητήθηκε

Πρώιμες εργασίες ανέφεραν ότι κύτταρα χωρίς μιτοχονδριακό DNA εξακολουθούν να υφίστανται φερρόπτωση, υποδηλώνοντας ότι τα μιτοχόνδρια δεν είναι απαραίτητα. Μεταγενέστερες εργασίες διαπίστωσαν ότι η απομάκρυνση των μιτοχονδρίων ή η αναστολή της αναπνοής μπορεί να καταστείλει τη φερρόπτωση από στέρηση κυστεΐνης, αλλά όχι από άμεση αναστολή της GPX4. Και τα δύο αποτελέσματα μπορούν να ισχύουν, εφόσον η συμβολή των μιτοχονδρίων εξαρτάται από τον επαγωγέα, τον κυτταρικό τύπο και το σημείο όπου συμβαίνει η καθοριστική υπεροξείδωση.

Η μελέτη στην οποία βασίζεται αυτό το άρθρο προσέγγισε τη διαφωνία με έναν ανιχνευτή ειδικό για ένα κυτταρικό διαμέρισμα. Το MitoCLox είναι μια μιτοχονδριακά στοχευμένη εκδοχή ενός δείκτη υπεροξείδωσης λιπιδίων: μεταβάλλει τον φθορισμό του όταν συναντά λιπιδικές υπεροξυλικές ρίζες μέσα στα μιτοχόνδρια. Σε ινοβλάστες που εκτέθηκαν σε εραστίνη, η οξείδωση του μιτοχονδριακού ανιχνευτή εμφανίστηκε σε ακόμη ζωντανά κύτταρα πριν από τον θάνατό τους και παρουσίαζε ετερογένεια στον κυτταρικό πληθυσμό. Αυτή η χρονική σειρά έχει σημασία. Η υπεροξείδωση που προηγείται του θανάτου αποτελεί πιθανή αιτία. Η υπεροξείδωση που μετριέται μόνο σε νεκρά κύτταρα αποτελεί κατάλοιπο. Ένας συνοδευτικός οδηγός για τις δοκιμασίες υπεροξείδωσης λιπιδίων και το τι καταγράφει κάθε ανιχνευτής εξηγεί γιατί η θέση του ανιχνευτή καθορίζει τη σημασία ενός σήματος.

Το ίδιο μοτίβο εμφανίστηκε σε ένα δεύτερο μοντέλο. Ινοβλάστες από ασθενή με κληρονομική οπτική νευροπάθεια Leber, οι οποίοι φέρουν μετάλλαξη του συμπλόκου I και υψηλότερο βασικό οξειδωτικό στρες, πέθαναν μέσω φερρόπτωσης όταν εξαντλήθηκε η γλουταθειόνη, ενώ οι ινοβλάστες της ομάδας ελέγχου αντιστάθηκαν. Η οξείδωση του μιτοχονδριακού ανιχνευτή προηγήθηκε και πάλι. Λεπτομέρειες υπάρχουν στη μελέτη ινοβλαστών για τη μιτοχονδριακή υπεροξείδωση λιπιδίων στη φερρόπτωση.

Τι άλλαξε το κυανό του μεθυλενίου σε αυτά τα πειράματα

Το κυανό του μεθυλενίου είναι φορέας οξειδοαναγωγής. Η οξειδωμένη μορφή του δέχεται ηλεκτρόνια από αντιδράσεις που συνδέονται με το NADH στο σύμπλοκο I και η ανηγμένη μορφή του τα δίνει στο κυτόχρωμα c, το οποίο τροφοδοτεί το σύμπλοκο IV. Αυτό δημιουργεί μια μερική παράκαμψη του τμήματος της αλυσίδας όπου τα ηλεκτρόνια κανονικά διαρρέουν προς το οξυγόνο, σχηματίζοντας υπεροξείδιο του ανιόντος. Οι αναγνώστες που θέλουν την πλήρη εικόνα αυτής της μεταφοράς μπορούν να ξεκινήσουν από το πώς το κυανό του μεθυλενίου μεταφέρει ηλεκτρόνια στα μιτοχόνδρια.

Σε πνευμονικούς ινοβλάστες που εκτέθηκαν σε εραστίνη, το κυανό του μεθυλενίου σε συγκέντρωση 250 nanomolar διατήρησε τη βιωσιμότητα σε μια μέτρηση κυτταρικής επιβίωσης, όπως και τα μιτοχονδριακά στοχευμένα αντιοξειδωτικά SkQ1 και MitoTEMPO. Οι έλεγχοι οριοθετούν το συμπέρασμα. Η φερροστατίνη-1, η άλφα-τοκοφερόλη και η δεφεροξαμίνη παρείχαν επίσης προστασία, επιβεβαιώνοντας ότι ο θάνατος ήταν φερροπτωτικός. Το ανάλογο του SkQ1 χωρίς αντιοξειδωτική ομάδα δεν παρείχε προστασία, υποδεικνύοντας ότι το αποτέλεσμα οφειλόταν σε οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις και όχι σε μη ειδική συσσώρευση. Η προστασία εξασθενούσε πάνω από περίπου 200 nanomolar SkQ1, σε συμφωνία με τη γνωστή προοξειδωτική συμπεριφορά των αντιοξειδωτικών κινονών σε υψηλότερα επίπεδα. Το κυανό του μεθυλενίου εμφανίζει την ίδια διττή συμπεριφορά ανάλογα με τη δόση: προστατευτική σε χαμηλά επίπεδα nanomolar σε αυτές τις κυτταρικές καλλιέργειες, αλλά με δυνατότητα παραγωγής υπεροξειδίου του υδρογόνου μέσω οξειδοαναγωγικών κύκλων όταν η συγκέντρωση αυξάνεται ή όταν εκτίθεται σε έντονο φως. Η σημασία αυτού του πλαισίου συγκέντρωσης εξετάζεται στο άρθρο για τις δραστικές μορφές οξυγόνου στα μιτοχόνδρια.

Στη συνέχεια, τα πειράματα σε απομονωμένα μιτοχόνδρια διαχώρισαν τις πηγές των ROS. Παρουσία δισθενούς σιδήρου, υποστρώματα που τροφοδοτούν το σύμπλοκο I μαζί με ροτενόνη ενίσχυσαν την οξείδωση του ανιχνευτή. Η ροτενόνη αναστέλλει τη μεταφορά ηλεκτρονίων μετά τη θέση της φλαβίνης, οπότε οι φορείς πριν από αυτό το σημείο παραμένουν ανηγμένοι και τα ηλεκτρόνια διαρρέουν προς το οξυγόνο από τη φλαβίνη που είναι στραμμένη προς τη μιτοχονδριακή μήτρα. Υποστρώματα που τροφοδοτούν το σύμπλοκο III μαζί με αντιμυκίνη A παρήγαγαν άφθονο υπεροξείδιο του υδρογόνου, αλλά δεν προκάλεσαν υπεροξείδωση λιπιδίων. Ίδιο συνολικό σήμα ROS, διαφορετική θέση, διαφορετικό αποτέλεσμα. Τόσο το SkQ1 όσο και το κυανό του μεθυλενίου κατέστειλαν την υπεροξείδωση που προκαλούνταν από το σύμπλοκο I χωρίς να καταστέλλουν την ίδια την παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου, γεγονός που τοποθετεί τη δράση τους μετά τον σχηματισμό των ROS, στο στάδιο της υπεροξείδωσης λιπιδίων.

Το σκέλος της υπερφόρτωσης σιδήρου και η ένδειξη από τη λιποφουσκίνη

Μια δεύτερη μελέτη εξέτασε το ερώτημα από την πλευρά του σιδήρου. Καρδιομυοκύτταρα H9c2 που εκτέθηκαν σε κιτρικό αμμώνιο τρισθενούς σιδήρου σε συγκεντρώσεις κάτω από την τάξη των millimolar εμφάνισαν μιτοχονδριακές ROS, μιτοχονδριακή υπεροξείδωση λιπιδίων και στη συνέχεια φερρόπτωση, ακολουθούμενη από συσσώρευση μιας χρωστικής που έμοιαζε με λιποφουσκίνη μέσα σε 24 ώρες. Η λιποφουσκίνη είναι το αυτοφθορίζον, σιδηρούχο κατάλοιπο οξειδωμένων λιπιδίων και πρωτεϊνών που συσσωρεύεται με την ηλικία, και η ταχεία εμφάνισή της εδώ συνδέει την οξεία υπεροξείδωση που προκαλεί ο σίδηρος με έναν κλασικό δείκτη γήρανσης. Τόσο το κυανό του μεθυλενίου σε συγκεντρώσεις της τάξης των nanomolar όσο και το SkQ1 απέτρεψαν την υπεροξείδωση, τον θάνατο και τη συσσώρευση της χρωστικής. Απομονωμένα καρδιακά μιτοχόνδρια επιβεβαίωσαν το μοτίβο: η ροτενόνη μαζί με δισθενή σίδηρο προκάλεσε υπεροξείδωση και σήμα που έμοιαζε με εκείνο της χρωστικής, και οι δύο παράγοντες το ανέστειλαν. Η πλήρης αλληλουχία περιγράφεται στη μελέτη υπερφόρτωσης σιδήρου σε καρδιομυοκύτταρα H9c2. Η πλευρά της χρωστικής εντάσσεται στο θέμα της λιποφουσκίνης και των δεικτών κυτταρικής γήρανσης.

Τι δεν δείχνουν οι δοκιμασίες κυτταρικής επιβίωσης

Μια μέτρηση βιωσιμότητας όπως το CellTiterBlue δείχνει πόσα κύτταρα σε μια καλλιέργεια παραμένουν μεταβολικά ενεργά μετά από έναν επαγωγέα μαζί με έναν υποψήφιο προστατευτικό παράγοντα. Πρόκειται για έλεγχο ενός μηχανισμού σε ένα καθορισμένο σύστημα. Δεν αποτελεί θεραπευτικό αποτέλεσμα. Κανένα από αυτά τα πειράματα δεν χορήγησε δόση σε ασθενή, δεν μέτρησε καταληκτικό σημείο νόσου ούτε καθόρισε θεραπευτικό παράθυρο σε έναν οργανισμό.

Τέσσερις περιορισμοί πρέπει να διατυπωθούν ρητά. Πρώτον, το εύρος των κυτταρικών τύπων είναι περιορισμένο: μετασχηματισμένοι πνευμονικοί ινοβλάστες, πρωτογενείς δερματικοί ινοβλάστες που περιλαμβάνουν μία σειρά με μιτοχονδριακή νόσο και μία σειρά καρδιομυοκυττάρων αρουραίου, καθώς και απομονωμένα μιτοχόνδρια καρδιάς αρουραίου. Η ευαισθησία διέφερε μεταξύ των σειρών και η σειρά LHON είχε επιλεγεί ακριβώς λόγω της ασυνήθιστα υψηλής ευπάθειάς της. Δεύτερον, οι επαγωγείς αντιστοιχούν σε ακραίες εργαστηριακές συνθήκες: πλήρη αναστολή μεταφοράς ή σύνθεσης και φορτία σιδήρου στα οποία κανένας ιστός δεν θα εκτιθόταν οξέως. Τρίτον, η συγκέντρωση δεν μετατρέπεται σε δόση με έναν απλό πολλαπλασιασμό. Μια συγκέντρωση της τάξης των nanomolar στο μέσο καλλιέργειας δεν αποτελεί ανθρώπινη δόση, και η κατανομή του κυανού του μεθυλενίου, η αναγωγή του στην άχρωμη μορφή του στο αίμα και στους ιστούς, η έκθεση στο φως και το δυναμικό της μεμβράνης παρεμβάλλονται όλα ανάμεσα στην καλλιέργεια και στον άνθρωπο. Τέταρτον, οι ανιχνευτές καταγράφουν το δικό τους διαμέρισμα. Η οξείδωση του MitoCLox δείχνει ότι σχηματίστηκαν μιτοχονδριακές λιπιδικές ρίζες· δεν δείχνει ότι η ρήξη της πλασματικής μεμβράνης, το πιθανό τελικό συμβάν, αποτράπηκε άμεσα και όχι ότι αποφεύχθηκε μέσω παρέμβασης σε προηγούμενο στάδιο.

Επομένως, το τεκμηριωμένο συμπέρασμα είναι το εξής: σε αυτά τα μοντέλα, οι ROS που προέρχονται από το σύμπλοκο I μαζί με τον σίδηρο προκαλούν μιτοχονδριακή υπεροξείδωση λιπιδίων που προηγείται της φερρόπτωσης, και το κυανό του μεθυλενίου σε χαμηλές συγκεντρώσεις διακόπτει αυτό το τμήμα της αλυσίδας. Οτιδήποτε πέρα από αυτό το τμήμα απαιτεί διαφορετικά πειράματα σε ζώα και στη συνέχεια σε ανθρώπους.