Γιατί η απορρόφηση του κυανού του μεθυλενίου αλλάζει με τη συγκέντρωση

Πάρτε μια φιάλη αρχικού διαλύματος κυανού του μεθυλενίου και γεμίστε δύο ποτήρια. Γεμίστε το πρώτο με το αρχικό διάλυμα και το δεύτερο με μια δεκαπλάσια αραίωσή του. Το δεύτερο ποτήρι έχει πιο ανοιχτό χρώμα, όπως αναμένεται. Κοιτάξτε προσεκτικά και θα δείτε ότι έχει αλλάξει και κάτι άλλο. Η απόχρωση έχει μετατοπιστεί. Το ένα διάλυμα τείνει προς ένα καθαρό γαλάζιο του ουρανού και το άλλο προς ένα μπλε με ιώδη χροιά. Η αραίωση δεν μείωσε απλώς την ένταση. Άλλαξε το χημικό είδος που ευθύνεται για το μεγαλύτερο μέρος της απορρόφησης.

Η ιδέα πίσω από αυτή τη μετατόπιση είναι απλή. Το διαλυμένο κυανό του μεθυλενίου δεν αποτελείται από ένα μόνο χημικό είδος. Το μεμονωμένο κατιόν της χρωστικής, που ονομάζεται μονομερές, μπορεί να στοιβαχθεί αντικριστά με ένα δεύτερο κατιόν και να σχηματίσει ένα διμερές, ενώ τα διμερή μπορούν να σχηματίσουν μεγαλύτερα συσσωματώματα. Κάθε μορφή έχει το δικό της φάσμα απορρόφησης. Αυτό που καταγράφει ένα φασματοφωτόμετρο είναι το άθροισμα των συνεισφορών του μείγματος που βρίσκεται στη συγκεκριμένη κυψελίδα, υπό τις συγκεκριμένες συνθήκες. Αν αλλάξει το μείγμα, μεταβάλλεται και το φάσμα, ακόμη και όταν η συνολική περιεκτικότητα σε χρωστική ακολουθεί μια απλή αναλογία αραίωσης.

Το μονομερές και το διμερές απορροφούν διαφορετικά

Φανταστείτε το μονομερές σαν μια επίπεδη κάρτα με θετικό φορτίο κατανεμημένο στο σύστημα των δακτυλίων του. Δύο τέτοιες κάρτες μπορούν να τοποθετηθούν αντικριστά. Τα θετικά φορτία απωθούνται, αλλά οι επίπεδες αρωματικές επιφάνειες έλκονται μέσω αλληλεπιδράσεων στοίβαξης, ενώ το νερό και τα αντισταθμιστικά ιόντα που τις περιβάλλουν θωρακίζουν την άπωση. Το αποτέλεσμα είναι ένα δεσμευμένο ζεύγος με κοινές ηλεκτρονικές καταστάσεις. Οι επιτρεπόμενες μεταπτώσεις του βρίσκονται σε υψηλότερη ενέργεια από τη μετάπτωση του μονομερούς, οπότε η ζώνη του διμερούς εμφανίζεται σε μικρότερο μήκος κύματος από τη ζώνη του μονομερούς. Τα μεγαλύτερα συσσωματώματα συνεισφέρουν ακόμη περισσότερο προς την κυανή πλευρά του φάσματος, σχηματίζοντας έναν ώμο.

Σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση μέσα σε καθαρό νερό, κυριαρχούν τα μονομερή και επικρατεί η ζώνη μεγάλου μήκους κύματος. Καθώς αυξάνεται η συνολική συγκέντρωση, η ζευγαρωμένη μορφή καταλαμβάνει όλο και μεγαλύτερο μερίδιο και η ζώνη μικρότερου μήκους κύματος ενισχύεται σε σχέση με την πρώτη. Επομένως, ο λόγος των δύο ζωνών δείχνει τη σύσταση του μείγματος, όχι άμεσα τη συνολική συγκέντρωση. Μια μέτρηση σε ένα μόνο μήκος κύματος δεν μπορεί να διαχωρίσει τις δύο μορφές χωρίς κάποια παραδοχή για το ποια είναι παρούσα.

Γι’ αυτό τα φάσματα αναφοράς πρέπει πάντα να συνοδεύονται από τις συνθήκες τους. Η φασματική αναφορά για το κυανό του μεθυλενίου παραθέτει σε πίνακα τις θέσεις των ζωνών μαζί με τον διαλύτη, το υπόβαθρο αλάτων, το pH, τη θερμοκρασία και το εύρος συγκεντρώσεων στις οποίες προέκυψαν. Αν αναφέρετε μια κορυφή χωρίς αυτές τις συνθήκες, ο αριθμός δεν προσδιορίζεται επαρκώς. Δύο εργαστήρια μπορεί να έχουν εξίσου σωστά αποτελέσματα για διαφορετικά φάσματα της ίδιας χρωστικής, επειδή μέτρησαν διαφορετικά μείγματα.

Τι μετατοπίζει την ισορροπία

Η συγκέντρωση είναι ο κύριος παράγοντας. Για να σχηματιστεί ένα διμερές, πρέπει να συναντηθούν δύο μονομερή, οπότε το μερίδιό του αυξάνεται ταχύτερα από γραμμικά ως προς τη συνολική ποσότητα χρωστικής. Οι αναφερόμενες σταθερές διμερισμού σε υδατικά διαλύματα είναι της τάξης των χιλιάδων ανά molar κοντά στη θερμοκρασία δωματίου, οπότε το μερίδιο των διμερών αυξάνεται απότομα στην περιοχή συγκεντρώσεων micromolar. Μια συνολική προσαρμογή δεδομένων που κάλυπτε συγκεντρώσεις χρωστικής από micromolar έως millimolar εντόπισε μη μηδενική συνεισφορά τετραμερών ήδη κάτω από 34 micromolar. Αυτό προειδοποιεί ότι μια προσαρμογή που περιορίζεται αυστηρά σε δύο χημικά είδη δεν είναι αξιόπιστη σε συγκεντρώσεις δεκάδων micromolar. Τα ακριβή κλάσματα εξαρτώνται από το μέσο, γι’ αυτό το άρθρο δίνει κατευθύνσεις και όχι έναν καθολικό πίνακα μετατροπής.

Το αλάτι είναι ο δεύτερος παράγοντας. Τα διαλυμένα ιόντα θωρακίζουν την άπωση μεταξύ δύο κατιόντων, οπότε η προσθήκη χλωριούχου νατρίου και παρόμοιων ηλεκτρολυτών ωθεί το μείγμα προς τα διμερή και τα συσσωματώματα στην ίδια συγκέντρωση χρωστικής. Αυτή η επίδραση είναι ορατή σε μελέτες συσσωμάτωσης του κυανού του μεθυλενίου σε αλατούχα και υδατικά μέσα, όπου μετρήθηκε χρωστική από περίπου 1 micromolar έως 3.4 millimolar, με συγκεντρώσεις χλωριούχου νατρίου από 0 έως 0.15 molar. Σε εκείνη την προσαρμογή, το κλάσμα των τετραμερών έφτασε περίπου το 0.93 στις υψηλότερες συγκεντρώσεις χρωστικής και αλάτων. Επομένως, ένα φάσμα που καταγράφεται σε νερό και ένα που καταγράφεται σε φυσιολογικό ορό δεν είναι εναλλάξιμα πρότυπα.

Η θερμοκρασία δρα προς την αντίθετη κατεύθυνση. Η στοίβαξη απελευθερώνει δεσμευμένο νερό και παρεμποδίζεται από τη θερμική κίνηση, οπότε η θέρμανση ενός διαλύματος συνήθως διασπά ορισμένα διμερή σε μονομερή, ενώ η ψύξη ευνοεί τη συσχέτιση. Η ενθαλπία διάστασης που προκύπτει από την προσαρμογή είναι αρνητική, περίπου μείον 30 kilojoules per mole στην περιοχή από 282 έως 333 kelvin, γεγονός που επιβεβαιώνει την εξώθερμη συσχέτιση. Ένα ψυχρό δείγμα που μετριέται αμέσως μετά την έξοδό του από το ψυγείο μπορεί να εμφανίζει μεγαλύτερη συσσωμάτωση από το ίδιο δείγμα αφού εξισορροπηθεί στη θερμοκρασία δωματίου.

Ο διαλύτης καθορίζει το σημείο εκκίνησης. Το νερό, με την έντονη υδρόφοβη επίδρασή του, ενθαρρύνει τη στοίβαξη των επίπεδων κατιόντων της χρωστικής. Αλκοόλες όπως η αιθανόλη και η μεθανόλη διαλυτοποιούν καλύτερα τους δακτυλίους και διασπούν τα συσσωματώματα, οπότε η ίδια συγκέντρωση χρωστικής εμφανίζεται περισσότερο ως μονομερές στην αιθανόλη παρά στο νερό. Το ίδιο κάνουν και οι απρωτικοί συνδιαλύτες: σε μείγματα νερού και DMSO στους 293 kelvin, η προσθήκη DMSO κατέστειλε τον διμερισμό, υποδεικνύοντας ότι η δομή του νερού αποτελεί κινητήριο παράγοντα της στοίβαξης. Οι επιφανειοδραστικές ουσίες απαιτούν προσοχή και προς τις δύο κατευθύνσεις. Πάνω από την κρίσιμη συγκέντρωση μικκυλίων τους, τα μικκύλια μπορούν να διαλυτοποιούν μεμονωμένα τα μονομερή και να αποκαθιστούν ένα φάσμα παρόμοιο με του μονομερούς. Κάτω από αυτό το σημείο, μια επιφανειοδραστική ουσία με αντίθετο φορτίο μπορεί, αντίθετα, να προάγει τη στοίβαξη: σε συγκέντρωση χρωστικής 100 micromolar, ο πολυμερισμός που προκαλούσε το SDS κορυφώθηκε κοντά στα 4 millimolar SDS, περίπου στο μισό της συγκέντρωσης σχηματισμού μικκυλίων, πριν από την ανακατανομή σε υψηλότερες συγκεντρώσεις επιφανειοδραστικής ουσίας. Εργασίες για τις επιδράσεις του διαλύτη και των οργανωμένων μέσων στα φάσματα του κυανού του μεθυλενίου δείχνουν πόσο έντονα το άμεσο μοριακό περιβάλλον, και όχι μόνο η συνολική συγκέντρωση, καθορίζει τις παρατηρούμενες ζώνες.

Το pH έχει σημασία κυρίως στις ακραίες τιμές. Στην περιοχή κοντά στο ουδέτερο pH που χρησιμοποιείται στις περισσότερες εργαστηριακές εργασίες, το κυανό του μεθυλενίου παραμένει στη γνωστή κατιονική κυανή μορφή του και η συσσωμάτωση κυριαρχεί στη φασματική συμπεριφορά. Τα ισχυρά οξέα ή οι ισχυρές βάσεις, η οξειδοαναγωγική χημεία που παράγει την άχρωμη λευκομορφή, καθώς και η δέσμευση σε πρωτεΐνες και σωματίδια προσθέτουν καταστάσεις πέρα από το ζεύγος μονομερούς-διμερούς. Όταν ένα φάσμα αλλάζει μετά την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος, ελέγξτε τη σύστασή του για άλατα και συστατικά που προκαλούν δέσμευση πριν αποδώσετε τα πάντα μόνο στο pH. Η αναφορά για τη χημεία και την πρωτονίωση διαχωρίζει αυτά τα ερωτήματα χημικής ταυτότητας από το ζήτημα της συσσωμάτωσης που εξετάζεται εδώ.

Γιατί καμπυλώνεται η ευθεία Beer-Lambert

Η σχέση Beer-Lambert ορίζει ότι η απορρόφηση ισούται με τον συντελεστή απορρόφησης επί τη συγκέντρωση επί το μήκος της οπτικής διαδρομής. Είναι ένας νόμος καταμέτρησης. Προϋποθέτει ότι τα αντικείμενα που καταμετρώνται παραμένουν ίδια καθώς αλλάζει ο αριθμός τους: ένα χημικό είδος που απορροφά, σταθερό φάσμα, καμία χημική μεταβολή με τη συγκέντρωση, μονοχρωματικό φως μέτρησης, απουσία σκέδασης ή επανεκπομπής και φως που πράγματι διανύει τη δηλωμένη διαδρομή.

Η συσσωμάτωση παραβιάζει την πρώτη παραδοχή. Τυπικά, η συνολική απορρόφηση παραμένει το άθροισμα των συνεισφορών των χημικών ειδών: το μήκος της οπτικής διαδρομής επί τον συντελεστή απορρόφησης κάθε είδους επί τη δική του συγκέντρωση. Κάθε είδος υπακούει στον νόμο. Το μείγμα δεν υπακούει, επειδή οι συγκεντρώσεις των επιμέρους ειδών είναι μη γραμμικές συναρτήσεις της συνολικής ποσότητας χρωστικής. Επομένως, μια καμπύλη βαθμονόμησης της απορρόφησης στη ζώνη του μονομερούς ως προς τη συνολική ποσότητα χρωστικής ξεκινά ως ευθεία στο όριο της μεγάλης αραίωσης και καμπυλώνεται προς τα κάτω καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση, επειδή κάθε πρόσθετη ποσότητα περιέχει αναλογικά λιγότερο μονομερές. Μια καμπύλη που καταγράφεται στη ζώνη του διμερούς καμπυλώνεται προς την αντίθετη κατεύθυνση. Οι εργασίες για τη συσσωμάτωση αναγνωρίζουν ακριβώς αυτόν τον μηχανισμό ως την πηγή των παρατηρούμενων αποκλίσεων από τον νόμο Lambert-Beer. Το συνηθισμένο σφάλμα είναι η προσαρμογή μιας ευθείας στην καμπυλωμένη περιοχή και η προέκτασή της. Η ευθεία ισχύει μόνο μέσα στο εύρος και στη μήτρα όπου δημιουργήθηκε.

Η αραίωση δημιουργεί μια συναφή παγίδα. Η αραίωση ενός πυκνού αρχικού διαλύματος ώστε να βρεθεί στο εύρος μέτρησης του οργάνου δεν διατηρεί την αναλογία των χημικών ειδών. Το αραιωμένο διάλυμα στην κυψελίδα επανέρχεται σε ισορροπία με μεγαλύτερο ποσοστό μονομερούς, οπότε το φάσμα του περιγράφει σωστά το αραιωμένο δείγμα αλλά όχι το αρχικό διάλυμα. Ο αναδρομικός υπολογισμός του φάσματος του αρχικού διαλύματος με αναλογική αύξηση των τιμών απορρόφησης αποκαθιστά την εκτίμηση της συνολικής περιεκτικότητας μόνο αν η βαθμονόμηση λαμβάνει ήδη υπόψη αυτή τη μετατόπιση. Δεν αποκαθιστά ποτέ το αρχικό σχήμα των ζωνών. Όποιος συγκρίνει το φάσμα ενός πυκνού διαλύματος με μια αραιή αναφορά συγκρίνει δύο διαφορετικά μείγματα.

Το μήκος της οπτικής διαδρομής είναι μέρος του αποτελέσματος

Η απορρόφηση μεταβάλλεται ανάλογα με την απόσταση που διανύει το φως μέσα στο δείγμα. Μια κυψελίδα 10 mm δίνει δεκαπλάσια απορρόφηση από μια κυψελίδα 1 mm που περιέχει το ίδιο διάλυμα. Αυτή η αναλογία είναι ακριβής μόνο για το ίδιο διάλυμα, και η συσσωμάτωση καθιστά αυτή την προϋπόθεση καθοριστική.

Στην πράξη, το μήκος της οπτικής διαδρομής είναι ένα εργαλείο για να παραμένει η μέτρηση μέσα στο έγκυρο εύρος. Μια μεγάλη διαδρομή παρέχει ευαισθησία για αραιά διαλύματα που αποτελούνται κυρίως από μονομερή. Μια μικρή διαδρομή κρατά ένα πυκνό δείγμα εντός της κλίμακας μέτρησης χωρίς μεγάλη αραίωση που θα επανακαθόριζε την ισορροπία. Το ερευνητικό πρόγραμμα συσσωμάτωσης από το οποίο προέρχονται οι παραπάνω αριθμοί εφάρμοσε ακριβώς αυτή την πρακτική: κυψελίδες 1 centimeter για συγκεντρώσεις χρωστικής από 1.1 έως 34 micromolar και κυψελίδες 0.01 centimeter για συγκεντρώσεις από 94 micromolar έως 3.4 millimolar. Οι βάσεις μέτρησης μικροόγκων και οι αναγνώστες μικροπλακών προσθέτουν τη δική τους γεωμετρία, με μικρές και μερικές φορές μεταβλητές διαδρομές, καθώς και επιφάνειες στις οποίες μπορεί να προσροφηθεί η κατιονική χρωστική. Αναφέρετε τη διαδρομή μαζί με την τιμή, όπως η φασματική αναφορά αναφέρει τον διαλύτη και το αλάτι. Μια τιμή απορρόφησης χωρίς μήκος οπτικής διαδρομής δεν είναι αποτέλεσμα. Είναι φήμη.

Ο μηχανισμός υπαγορεύει την ορθή πρακτική μέτρησης. Εξισορροπήστε τα δείγματα στην ίδια θερμοκρασία πριν από τη μέτρηση. Χρησιμοποιήστε τον ίδιο τύπο κυψελίδας και τον ίδιο προσανατολισμό, αντίστοιχα τυφλά δείγματα με το ίδιο υπόβαθρο αλάτων και ρυθμιστικού διαλύματος, καθώς και καθαρά γυάλινα σκεύη, επειδή το κυανό του μεθυλενίου προσροφάται στο γυαλί και στο πλαστικό και μια χρωματισμένη κυψελίδα διατηρεί ίχνη του τελευταίου πυκνού δείγματος. Μετρήστε σύντομα μετά την παρασκευή όταν η κινητική της συσσωμάτωσης έχει σημασία και δημιουργήστε κάθε καμπύλη βαθμονόμησης στην ίδια μήτρα και με το ίδιο μήκος οπτικής διαδρομής όπως τα άγνωστα δείγματα. Για τους οπτικούς ελέγχους, θυμηθείτε ότι το μάτι είναι κακό φασματόμετρο. Το αν το χρώμα του διαλύματος μπορεί να τεκμηριώσει την καθαρότητα είναι ένα ξεχωριστό ερώτημα με αρνητική απάντηση, και οι μεταβολές της απόχρωσης λόγω συσσωμάτωσης είναι ένας από τους λόγους.

Ένα διάγραμμα για να έχετε δίπλα στο όργανο

Το παρακάτω σχήμα συνοψίζει το άρθρο σε έναν οδηγό αναφοράς για τον εργαστηριακό πάγκο. Τρία διαλύματα περιέχουν την ίδια χρωστική, αλλά διαφέρουν ως προς τη συνολική συγκέντρωση και το υπόβαθρο αλάτων. Τα σχηματικά φάσματά τους δείχνουν τη ζώνη μεγάλου μήκους κύματος του μονομερούς να χάνει μερίδιο προς όφελος της ζώνης μικρότερου μήκους κύματος του διμερούς, καθώς αυξάνεται η στοίβαξη. Οι συνθήκες αναγράφονται στο σχήμα, επειδή χωρίς αυτές οι καμπύλες δεν μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν. Για μετρημένες θέσεις ζωνών υπό δηλωμένες συνθήκες, χρησιμοποιήστε τη φασματική αναφορά. Για το πώς η χρωστική εισέρχεται στα κύτταρα αφού βρεθεί σε διάλυμα, δείτε την κυτταρική είσοδο μέσω αναγωγής και κατανομής. Για το πώς η δόση φωτός και η γεωμετρία διαμορφώνουν περαιτέρω τις φωτοχημικές μετρήσεις, δείτε την έκθεση στο φως και τη γεωμετρία μέτρησης.

Ο βασικός κανόνας έχει δύο σκέλη. Το φάσμα ταυτοποιεί το μείγμα που βρίσκεται στην κυψελίδα υπό τις δηλωμένες συνθήκες. Μόνο μια βαθμονόμηση που έχει δημιουργηθεί υπό τις ίδιες συνθήκες μετατρέπει μια τιμή απορρόφησης σε συνολική συγκέντρωση.