Κυανό του μεθυλενίου και γήρανση του σκελετού: γιατί τα κυτταρικά ευρήματα δεν προέβλεψαν τα αποτελέσματα στα οστά ποντικών

Φανταστείτε μια ένωση που περιορίζει τη δραστηριότητα των ίδιων των κυττάρων που καταστρέφουν το οστό, δοκιμάζεται σε τρυβλίο και λειτουργεί ακριβώς όπως αναμενόταν. Λιγότεροι πολυπύρηνοι οστεοκλάστες, σαφής δοσοεξαρτώμενη απόκριση και μια εύλογη μιτοχονδριακή εξήγηση. Στη συνέχεια, η ίδια ένωση χορηγείται σε ποντικούς για το μεγαλύτερο μέρος της ενήλικης ζωής τους, οι σκελετοί τους σαρώνονται σε τρεις διαστάσεις και δεν παρατηρείται καμία διαφορά. Τα γηρασμένα οστά φαίνονται γηρασμένα, είτε χορηγήθηκε η ένωση είτε όχι.

Αυτή είναι η ειλικρινής εικόνα μιας μελέτης του 2024 και αξίζει να την κατανοήσουμε με ακρίβεια, επειδή βρίσκεται ακριβώς στο σημείο όπου καταρρέουν οι περισσότεροι ισχυρισμοί για συμπληρώματα και οστά. Πρόκειται για την εργασία των Poudel και συνεργατών, που δημοσιεύτηκε στο Aging τον Μάρτιο του 2024. Είναι ανοικτής πρόσβασης, επομένως κάθε μέτρηση παρακάτω μπορεί να ελεγχθεί στην πηγή. Το βασικό της εύρημα είναι ένα μηδενικό αποτέλεσμα. Τα μηδενικά αποτελέσματα δεν είναι αποτυχίες. Είναι απαντήσεις, και αυτό απαντά καλά σε ένα συγκεκριμένο ερώτημα: διατηρεί η μακροχρόνια συστηματική αντιοξειδωτική αγωγή με κυανό του μεθυλενίου ή μιτοκινόνη τον γηράσκοντα σκελετό των ποντικών; Όχι.

Πώς αποτυπώνεται η γήρανση των οστών σε αριθμούς

Η οστική απώλεια με την ηλικία δεν είναι ένα ενιαίο φαινόμενο, επομένως η μελέτη δεν μέτρησε ένα μόνο χαρακτηριστικό. Χρησιμοποιώντας μικροϋπολογιστική τομογραφία, οι ερευνητές σάρωσαν τρεις σκελετικές θέσεις: το φλοιώδες οστό στο μέσο της διάφυσης του μηριαίου (το συμπαγές κεντρικό τμήμα), το δοκιδωτό οστό στην άπω μετάφυση του μηριαίου (το σπογγώδες δίκτυο κοντά στην άρθρωση) και το δοκιδωτό οστό στον πέμπτο οσφυϊκό σπόνδυλο. Σε κάθε θέση κατέγραψαν τις συνήθεις παραμέτρους μικροαρχιτεκτονικής. Το BV/TV είναι το κλάσμα ενός όγκου που καταλαμβάνεται από οστό και όχι από μυελικό χώρο. Το BMD είναι η οστική μεταλλική πυκνότητα. Τα Tb.Th, Tb.N και Tb.Sp περιγράφουν το πάχος, τον αριθμό και την απόσταση μεταξύ των οστικών δοκίδων. Το πάχος του φλοιού και τα εμβαδά διατομής περιγράφουν τη διάφυση.

Σκεφτείτε το δοκιδωτό οστό σαν ένα ικρίωμα μέσα σε μια αποθήκη. Η γήρανση αφαιρεί εντελώς ορισμένα στηρίγματα και λεπταίνει τα υπόλοιπα, οπότε μειώνεται το κλάσμα του χώρου που καταλαμβάνει η δομή, τα εναπομείναντα στηρίγματα απέχουν περισσότερο μεταξύ τους και ολόκληρος ο σκελετός της κατασκευής αντέχει μικρότερο φορτίο. Το φλοιώδες οστό είναι ο ίδιος ο τοίχος της αποθήκης, που γίνεται λεπτότερος. Μια αγωγή που προστατεύει τον σκελετό θα πρέπει να αποτυπώνεται σε αυτούς τους αριθμούς. Αυτόν τον έλεγχο εφάρμοσε η μελέτη.

Τι συνέβη στο τρυβλίο

Η κυτταρική εργασία χρησιμοποίησε μυελό από τα μηριαία και τις κνήμες ποντικών UM-HET3 ηλικίας 6 έως 7 μηνών, ενός γενετικά ποικιλόμορφου στελέχους που εκτρέφεται για την έρευνα της γήρανσης. Προέκυψαν τέσσερα ευρήματα, τα οποία δείχνουν προς διαφορετικές κατευθύνσεις, επομένως το καθένα χρειάζεται ξεχωριστή αναφορά.

Πρώτον, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα, ο πληθυσμός που περιλαμβάνει τα μελλοντικά οστεοπαραγωγά κύτταρα, παρέμειναν βιώσιμα σε συγκεντρώσεις κυανού του μεθυλενίου και μιτοκινόνης από 0.125 έως 0.5 micromolar για 48 ώρες. Ούτε τοξικότητα ούτε ενίσχυση. Δεύτερον, όταν αυτά τα βλαστοκύτταρα οδηγήθηκαν σε διαφοροποίηση προς οστεοβλάστες σε οστεογενετικό μέσο και χρωματίστηκαν για αλκαλική φωσφατάση την ημέρα 18, καμία από τις δύο ενώσεις δεν άλλαξε το αποτέλεσμα σε οποιαδήποτε από τις συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν. Η πλευρά του τρυβλίου που παράγει οστό δεν ανταποκρίθηκε.

Τρίτον, η πλευρά που απορροφά οστό ανταποκρίθηκε. Πρόδρομα κύτταρα του μυελού που διεγέρθηκαν με M-CSF και RANKL, την καθιερωμένη συνταγή για την παραγωγή οστεοκλαστών, σχημάτισαν λιγότερα πολυπύρηνα κύτταρα θετικά για TRAP όσο αυξανόταν η συγκέντρωση. Η σαφής μείωση εμφανίστηκε πάνω από 0.25 micromolar, στην πράξη στην υψηλότερη εξετασθείσα συγκέντρωση των 0.5. Αυτό είναι το εύρημα που τροφοδοτεί αμέτρητες αισιόδοξες περιλήψεις και είναι πραγματικό εντός των ορίων του: η άμεση, συνεχής έκθεση σε καλλιέργεια κατέστειλε τον σχηματισμό οστεοκλαστών με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

Τέταρτον, ώριμοι οστεοβλάστες που εκτέθηκαν για 48 ώρες και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μιτοχονδριακού στρες δεν παρουσίασαν σημαντική μεταβολή στη βασική ή στη μέγιστη κατανάλωση οξυγόνου με καμία από τις δύο ενώσεις. Στα 0.5 micromolar, και οι δύο φάνηκε να μειώνουν ελαφρώς την αναπνοή, αλλά η μεταβολή δεν έφτασε σε στατιστική σημαντικότητα. Επομένως, το τρυβλίο δεν έδειξε αποκατάσταση της μιτοχονδριακής λειτουργίας στα οστεοπαραγωγά κύτταρα που να συνοδεύει την επίδραση στους οστεοκλάστες. Ο προτεινόμενος μηχανισμός, η βελτίωση της ενεργειακής λειτουργίας μέσω της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων, δεν παρήγαγε μετρήσιμη αύξηση της αναπνοής εκεί όπου την αναζήτησαν οι ερευνητές.

Τι συνέβη στους ποντικούς

Ακολούθησαν δύο πειράματα σε ζώα, σε πολύ διαφορετικές κλίμακες.

Το μικρότερο χρησιμοποίησε θηλυκούς ποντικούς του ενδογαμικού στελέχους C57BL/6J, που χρησιμοποιείται ευρέως στη βιοϊατρική έρευνα. Από την ηλικία των 18 μηνών, περίπου το τέλος της μέσης ηλικίας για έναν ποντικό, οι μισοί έπιναν νερό που περιείχε κυανό του μεθυλενίου σε συγκέντρωση 250 micromolar για 6 ή 12 μήνες, μέχρι την ηλικία των 24 ή 30 μηνών. Θηλυκοί ποντικοί ηλικίας 18 μηνών χωρίς αγωγή έδωσαν τις τιμές αναφοράς, ενώ θηλυκοί ηλικίας 5 μηνών έδειξαν την εικόνα του νεαρού οστού. Η γήρανση έκανε ακριβώς αυτό που κάνει η γήρανση. Στον σπόνδυλο L5, το κλάσμα οστικού όγκου μειώθηκε κατά περίπου 35 τοις εκατό, η οστική μεταλλική πυκνότητα κατά περίπου 18 τοις εκατό και ο αριθμός των δοκίδων περίπου στο μισό, ανεξάρτητα από την αγωγή. Το πάχος του φλοιού μειώθηκε κατά περίπου 10 τοις εκατό μεταξύ 18 και 24 μηνών και κατά περίπου 30 τοις εκατό έως τους 30 μήνες. Το κυανό του μεθυλενίου δεν άλλαξε την πορεία καμίας από αυτές τις καμπύλες.

Το μεγαλύτερο πείραμα πραγματοποιήθηκε μέσω του Προγράμματος Δοκιμών Παρεμβάσεων του Εθνικού Ινστιτούτου Γήρανσης, το οποίο εξετάζει υποψήφιες ενώσεις σε ποντικούς UM-HET3 και των δύο φύλων, σε τρία ερευνητικά κέντρα. Το κυανό του μεθυλενίου σε συγκέντρωση 28 μερών ανά εκατομμύριο στην τροφή και η μιτοκινόνη σε συγκέντρωση 100 μερών ανά εκατομμύριο άρχισαν να χορηγούνται στην πρώιμη ενήλικη ζωή και συνεχίστηκαν μέχρι περίπου την ηλικία των 22 έως 24 μηνών. Οι ίδιες τρεις σκελετικές θέσεις εξετάστηκαν με micro-CT. Ο δημοσιευμένος πίνακας αναφέρει κάθε παράμετρο ανά φύλο και αγωγή, με προσαρμοσμένες στατιστικές αναλύσεις, και η στήλη της αγωγής δείχνει παντού το ίδιο: καμία σημαντική επίδραση, καμία αλληλεπίδραση αγωγής και φύλου, σε καμία θέση. Φλοιώδες ή δοκιδωτό οστό, μηριαίο ή σπονδυλική στήλη, αρσενικά ή θηλυκά, κυανό του μεθυλενίου ή μιτοκινόνη. Ο σκελετός γέρασε όπως αναμενόταν.

Ο συγκριτικός πίνακας που συνδέει τα δύο σκέλη

Αυτός είναι ο πίνακας στον οποίο στηρίζεται ολόκληρο το άρθρο. Κάθε γραμμή αντιπαραβάλλει τι έδειξε το τρυβλίο με τι έδειξε το ζώο για την ίδια βιολογική διεργασία, χρησιμοποιώντας τις μετρήσεις της ίδιας της μελέτης.

Διαβάζοντας τον πίνακα γραμμή προς γραμμή, το παράδοξο διαλύεται. Μόνο μία από τις τέσσερις κυτταρικές διεργασίες ανταποκρίθηκε, και μάλιστα μόνο κοντά στο ανώτερο όριο του εξετασθέντος εύρους, υπό συνεχή άμεση έκθεση. Όλα τα υπόλοιπα στο τρυβλίο είχαν ήδη μηδενικό αποτέλεσμα. Έτσι, το αποτέλεσμα στα ζώα μοιάζει λιγότερο με αντίφαση και περισσότερο με επιβεβαίωση: τρία μηδενικά αποτελέσματα και μία επίδραση υπό προϋποθέσεις στην καλλιέργεια μετατράπηκαν σε μηδενικό αποτέλεσμα σε όλα τα εξεταζόμενα χαρακτηριστικά του ζώου.

Η δομή των οστών δεν είναι διάρκεια ζωής

Μια σύγχυση αξίζει ξεχωριστή ενότητα, επειδή το κυανό του μεθυλενίου έχει πράγματι ευρήματα για τη διάρκεια ζωής, τα οποία είναι εύκολο να παρερμηνευθούν ως ευρήματα για τα οστά. Στην προηγούμενη κοόρτη του Προγράμματος Δοκιμών Παρεμβάσεων, το κυανό του μεθυλενίου στην ίδια δόση μέσω της τροφής αύξησε το 90ό εκατοστημόριο της διάρκειας ζωής των θηλυκών UM-HET3 κατά περίπου 6 τοις εκατό. Πρόκειται για επίδραση στην επιβίωση σε προχωρημένη ηλικία, χωρίς μεταβολή στη διάμεση διάρκεια ζωής και χωρίς επίδραση στα αρσενικά. Η μιτοκινόνη δεν έδειξε επίδραση στη διάρκεια ζωής σε κανένα φύλο. Αυτοί οι αριθμοί επιβίωσης προέρχονται από τα δημοσιευμένα δεδομένα μακροζωίας του προγράμματος, όχι από την εργασία για τα οστά.

Η συμβολή της εργασίας για τα οστά είναι ότι κρατά αυτούς τους λογαριασμούς χωριστούς. Μια ένωση μπορεί να μεταβάλει την επιβίωση σε προχωρημένη ηλικία στο ένα φύλο, χωρίς να διατηρεί κανένα μετρημένο χαρακτηριστικό του σκελετού. Η επιβίωση καταμετρά θανάτους από όλες τις αιτίες· η micro-CT καταμετρά δοκίδες σε έναν σπόνδυλο. Δεν υπάρχει κανόνας που να απαιτεί μια παρέμβαση να δρα μέσω των οστών για να παρατείνει τη ζωή, και αυτή η μελέτη παρέχει άμεση ένδειξη ότι η επίδραση του κυανού του μεθυλενίου σε προχωρημένη ηλικία στα θηλυκά ακολούθησε κάποια άλλη οδό. Όποιος επικαλείται το εύρημα για τη διάρκεια ζωής ως υποστήριξη για το κυανό του μεθυλενίου και την οστεοπόρωση αντλεί τεκμηρίωση από τον λάθος λογαριασμό. Η γενική αρχή του διαχωρισμού αυτών των λογαριασμών καλύπτεται στο άρθρο πώς να διαβάζετε την έρευνα για το κυανό του μεθυλενίου.

Γιατί το τρυβλίο δεν προέβλεψε τον ποντικό

Πέντε εξηγήσεις ταιριάζουν στα δεδομένα και δεν αλληλοαποκλείονται.

Η πρώτη είναι η έκθεση. Τα κύτταρα στην καλλιέργεια βρίσκονταν συνεχώς σε γνωστές συγκεντρώσεις των ενώσεων. Οι ποντικοί έτρωγαν τροφή με τις ενώσεις επί μήνες, και η μελέτη δεν μέτρησε ούτε τα επίπεδά τους στον μυελό ούτε κάποιον δείκτη οξειδωτικής βλάβης στα οστά. Μια συγκέντρωση που καταστέλλει τους οστεοκλάστες όταν εφαρμόζεται άμεσα μπορεί να μη φτάνει ποτέ σε αυτό το επίπεδο στα πρόδρομα κύτταρα του μυελού. Η εργασία εξέτασε μία δόση ανά ένωση in vivo, επομένως η δοσοεξαρτώμενη απόκριση στο ζώο παραμένει άγνωστη.

Η δεύτερη είναι η χημεία. Οι δραστικές μορφές οξυγόνου δεν αποτελούν μία ενιαία, ομοιόμορφα αναμεμειγμένη δεξαμενή μέσα στο κύτταρο. Δρουν σε μικρά διαμερίσματα και σε σύντομες χρονικές κλίμακες, ενώ τα μιτοχονδριακά, κυτταροπλασματικά και μεμβρανικά οξειδοαναγωγικά κυκλώματα λειτουργούν εν μέρει ανεξάρτητα. Η μιτοκινόνη είναι σχεδιασμένη να συγκεντρώνεται στα μιτοχόνδρια, ενώ τα οξειδωτικά σήματα που προάγουν τον σχηματισμό οστεοκλαστών μπορούν να προέρχονται από αλλού. Η μείωση μιας τέτοιας δεξαμενής δεν αναπαράγει απαραίτητα όσα επιτυγχάνει η συνεχής έκθεση ολόκληρου του κυττάρου.

Η τρίτη είναι η σύζευξη. Στο ζωντανό οστό, η απορρόφηση και ο σχηματισμός συνδέονται: οι οστεοκλάστες και τα γειτονικά τους κύτταρα εκπέμπουν σήματα που στρατολογούν οστεοπαραγωγά κύτταρα στη θέση όπου μόλις απορροφήθηκε οστό. Η καταστολή του σχηματισμού οστεοκλαστών δεν προσθέτει ισόποσο οστό, επειδή μπορεί επίσης να αφαιρέσει τα σήματα που καλούν τους «οικοδόμους». Ένα τρυβλίο που περιέχει μόνο πρόδρομα κύτταρα δεν μπορεί να δείξει αυτή την ανατροφοδότηση. Ένας σκελετός δεν μπορεί να την κρύψει.

Η τέταρτη είναι η φόρτιση. Τα οστεοκύτταρα αντιλαμβάνονται τη μηχανική παραμόρφωση και καθορίζουν την ισορροπία αναδιαμόρφωσης ολόκληρου του οστού. Καθώς τα ζώα γερνούν και κινούνται λιγότερο, το μηχανικό σήμα εξασθενεί και ακολουθεί απώλεια, ανεξάρτητα από μια περιορισμένη φαρμακολογική επίδραση σε έναν τύπο κυττάρου. Οι ίδιοι οι συγγραφείς αναφέρουν την άσκηση και τη φόρτιση που διεγείρει τον οστικό σχηματισμό ως πιθανότερο μοχλό παρέμβασης, έναν διακριτικό τρόπο να πουν ότι ο σκελετός ακούει περισσότερο τη φυσική παρά την οξειδοαναγωγική χημεία.

Η πέμπτη είναι ο χρόνος έναρξης, με μια επιφύλαξη. Στο πείραμα C57BL/6J, η αγωγή άρχισε στους 18 μήνες, όταν είχε ήδη συμβεί σημαντική δομική απώλεια, και καμία αντιοστεοαπορροφητική παρέμβαση δεν μπορεί να ανακατασκευάσει δοκίδες που έχουν διατρηθεί και αφαιρεθεί χωρίς αντίστοιχο ερέθισμα οστικού σχηματισμού. Όμως ο χρόνος έναρξης δεν μπορεί να εξηγήσει τα πάντα, επειδή η χορήγηση στο Πρόγραμμα Δοκιμών Παρεμβάσεων άρχισε στην πρώιμη ενήλικη ζωή και πάλι δεν άλλαξε τίποτα. Η καθυστερημένη έναρξη εξηγεί μέρος του ενός πειράματος. Δεν εξηγεί κανένα μέρος του άλλου.

Τι σημαίνει αυτό για τους ισχυρισμούς σχετικά με το κυανό του μεθυλενίου και την οστεοπόρωση

Για έναν αναγνώστη που αξιολογεί το κυανό του μεθυλενίου για την υγεία των οστών ή τη γήρανση του σκελετού, το πρακτικό συμπέρασμα είναι σύντομο. Τα καλύτερα διαθέσιμα μακροχρόνια δεδομένα σε ποντικούς δεν αναφέρουν όφελος για τον σκελετό από τη χρόνια χορήγηση κυανού του μεθυλενίου ή μιτοκινόνης, παρά την πραγματική καταστολή του σχηματισμού οστεοκλαστών στην καλλιέργεια. Η βιβλιογραφία για τη διάρκεια ζωής αποδίδει στο κυανό του μεθυλενίου μια μικρή επίδραση σε προχωρημένη ηλικία μόνο στα θηλυκά, η οποία, όπως δείχνει αυτή η μελέτη, δεν μεσολαβήθηκε από τα οστά. Κανένας από τους δύο λογαριασμούς δεν υποστηρίζει χρήση σε ανθρώπους για την οστεοπόρωση, και δεν περιλαμβάνονται καθόλου δεδομένα για ανθρώπινα οστά. Τα ερωτήματα για τη δοσολογία και την ασφάλεια των προϊόντων στους ανθρώπους ανήκουν στο άρθρο ασφάλεια και ανεπιθύμητες ενέργειες του κυανού του μεθυλενίου, όχι σε αυτόν τον σκελετό ποντικού.

Το βαθύτερο δίδαγμα αφορά τη σειρά των τεκμηρίων. Ένα κυτταρικό αποτέλεσμα είναι μια διαπίστωση για το τι μπορεί να κάνει μια ένωση σε έναν τύπο κυττάρου υπό ελεγχόμενη έκθεση. Ένα οστικό αποτέλεσμα είναι μια διαπίστωση για το τι προκαλούν μήνες συστηματικής έκθεσης σε ένα όργανο που συνδέει δύο τύπους κυττάρων υπό μηχανικό έλεγχο. Στο πρώτο γεννιούνται οι υποθέσεις. Στο δεύτερο, για τη γήρανση του σκελετού και αυτά τα δύο αντιοξειδωτικά, αυτή η υπόθεση έπαψε να στηρίζεται.