Εναλλακτικές στο κυανό του μεθυλενίου για μικροσκοπία: επιλογή ανά εργασία

Για ένα απλό βακτηριακό επίχρισμα, η κρυσταλλική ιώδης μπορεί να αντικαταστήσει το κυανό του μεθυλενίου όταν ο στόχος είναι η παρατήρηση του σχήματος των κυττάρων. Για ζωντανά κύτταρα, καλύτερη εναλλακτική μπορεί να είναι η αντίθεση φάσης χωρίς καθόλου χρώση. Η επιλογή εξαρτάται από την παρατήρηση που χρειάζεται να κάνετε.

Ας υποθέσουμε ότι δύο άτομα εξετάζουν την ίδια βακτηριακή καλλιέργεια. Το ένα θέλει να διακρίνει τα ραβδόμορφα από τα σφαιρικά κύτταρα. Το άλλο θέλει να γνωρίζει αν μια επεξεργασία έχει σκοτώσει τα βακτήρια. Μια χρώση που δίνει στο πρώτο άτομο καθαρή εικόνα μπορεί να μην παρέχει στο δεύτερο καμία αξιοποιήσιμη απάντηση.

Πριν επιλέξετε υποκατάστατο, συμπληρώστε αυτή την πρόταση: «Χρειάζεται να παρατηρήσω ___ σε ___, και τα κύτταρα πρέπει / δεν χρειάζεται να παραμείνουν ζωντανά.» Αυτή η πρόταση ορίζει την εργασία που πρέπει να επιτελέσει η χρώση.

Ξεκινήστε από το δείγμα και το ερώτημα

Αρχικά αποφασίστε αν τα κύτταρα πρέπει να παραμείνουν ζωντανά και έπειτα προσδιορίστε το χαρακτηριστικό που χρειάζεται να παρατηρήσετε:

• Τα κύτταρα πρέπει να παραμείνουν ζωντανά: για κίνηση ή σχήμα, εξετάστε την αντίθεση φάσης χωρίς χρώση ή το DIC· για πυρηνικό DNA, εξετάστε το Hoechst 33342 με φθορισμό· για ακεραιότητα μεμβράνης, επιλέξτε μια επικυρωμένη δοκιμασία όπως SYTO 9 με ιωδιούχο προπίδιο.
• Τα κύτταρα δεν χρειάζεται να παραμείνουν ζωντανά: για βακτηριακή μορφολογία, εξετάστε μια απλή χρώση με κρυσταλλική ιώδη ή αρνητική χρώση με νιγροσίνη· για αντίδραση Gram, χρησιμοποιήστε την πλήρη μέθοδο χρώσης Gram· για πυρηνικό DNA σε μονιμοποιημένα κύτταρα, εξετάστε φθορισμό DAPI.

Χρησιμοποιήστε αυτόν τον πίνακα για να συγκρίνετε τους περιορισμούς κάθε επιλογής. Πρόκειται για επιλογές μεθόδου και όχι για οδηγίες αντικατάστασης φιαλών αντιδραστηρίων μέσα σε ένα υπάρχον πρωτόκολλο.

Για ένα απλό επίχρισμα, αντικαταστήστε τη μέθοδο με προσοχή

Η κρυσταλλική ιώδης αποτελεί πρακτική επιλογή όταν η εργασία απαιτεί μονόχρωμη απεικόνιση της βακτηριακής μορφολογίας. Το Bacteriological Analytical Manual του FDA παραθέτει δύο συνθέσεις κρυσταλλικής ιώδους κατάλληλες για απλή χρώση. Χρησιμοποιήστε τεκμηριωμένη σύνθεση και τη μέθοδο παρασκευής της· μόνο η ονομασία της χρωστικής δεν προσδιορίζει ένα έτοιμο προς χρήση αντιδραστήριο.

Η κρυσταλλική ιώδης χρησιμοποιείται επίσης στη χρώση Gram, αλλά αυτό δεν σημαίνει ότι μια απλή χρώση με κρυσταλλική ιώδη είναι χρώση Gram. Στο πρωτόκολλο χρώσης Gram της ASM, το διαφοροποιητικό αποτέλεσμα εξαρτάται από την κρυσταλλική ιώδη, το ιώδιο, τον αποχρωματισμό και την αντίχρωση που εφαρμόζονται διαδοχικά. Η παράλειψη αυτών των σταδίων αλλάζει το τι μπορεί να τεκμηριώσει η εικόνα. Δείτε τη σύγκριση απλής χρώσης και χρώσης Gram για αυτή τη διάκριση.

Η νιγροσίνη προσφέρει διαφορετικό τρόπο ανάδειξης των περιγραμμάτων: σκουραίνει το φόντο, ενώ τα βακτηριακά κύτταρα παραμένουν συγκριτικά ανοιχτόχρωμα. Υπάρχει μια χρήσιμη λεπτομέρεια στις οδηγίες της Merck για τη νιγροσίνη που μπορεί να παραλείπεται από έναν γενικό κατάλογο υποκατάστατων. Η καθορισμένη σύνθεση εργασίας περιλαμβάνει φορμαλδεΰδη. Επομένως, δεν μπορείτε να συμπεράνετε συμβατότητα με ζωντανά κύτταρα μόνο από τον όρο «αρνητική χρώση», ακόμη κι αν τα ίδια τα κύτταρα φαίνονται άχρωμα. Ελέγξτε την πλήρη σύνθεση και την προετοιμασία του δείγματος.

Για ζωντανά δείγματα, εξετάστε το ενδεχόμενο αλλαγής του οπτικού συστήματος

Αν θέλετε να παρακολουθήσετε κύτταρα να κινούνται ή να διαιρούνται, η προσθήκη μιας ακόμη χρωστικής μπορεί να περιπλέξει την παρατήρηση. Όπως εξηγεί η Nikon στον οδηγό της για την αντίθεση σε διαφανή δείγματα, η αντίθεση φάσης και η διαφορική συμβολομετρική αντίθεση, ή DIC, καθιστούν τα δείγματα ορατά μέσω διαφορών στις οπτικές τους ιδιότητες. Μπορούν να αναδείξουν ζωντανά, άχρωμα κύτταρα, εφόσον το μικροσκόπιο διαθέτει τα απαιτούμενα εξαρτήματα.

Αυτή η επιλογή διατηρεί το παρασκεύασμα χωρίς χρώση, αλλά μεταβάλλει τις διαθέσιμες πληροφορίες. Μπορείτε να παρακολουθήσετε ένα όριο ή μια κίνηση χωρίς να γνωρίζετε ποιο μόριο δημιούργησε την αντίθεση. Αν το ερώτημα αφορά τον μοριακό εντοπισμό, επιλέξτε αντί γι' αυτό μια κατάλληλη μέθοδο σήμανσης.

Για το πυρηνικό DNA, η σύγκριση των χρώσεων DAPI και Hoechst από την Invitrogen διακρίνει τη συνήθη χρήση του DAPI σε μονιμοποιημένα κύτταρα από το περισσότερο διαπερατό στα κύτταρα Hoechst 33342, το οποίο προτιμάται για σήμανση ζωντανών κυττάρων. Και τα δύο απαιτούν εξοπλισμό φθορισμού. Κανένα δεν αποτελεί άμεση αντικατάσταση μιας έγχρωμης χρώσης φωτεινού πεδίου.

Αντιμετωπίστε την έκθεση στη χρωστική και τον φωτισμό ως πειραματικές συνθήκες. Συγκρίνετε χρωσμένα και άχρωμα παρασκευάσματα όταν η συμπεριφορά των κυττάρων αποτελεί τη μέτρησή σας.

Ένα κόκκινο κύτταρο δεν είναι αυτομάτως νεκρό κύτταρο

Τα SYTO 9 και ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιούνται συχνά μαζί για την αξιολόγηση της ακεραιότητας της βακτηριακής μεμβράνης. Το εγχειρίδιο BacLight συσχετίζει τις άθικτες μεμβράνες με πράσινη χρώση και τις κατεστραμμένες μεμβράνες με κόκκινη χρώση. Αυτή η ερμηνεία χρειάζεται επικύρωση για το συγκεκριμένο δείγμα.

Μια μελέτη του 2019 από τον Rosenberg και συνεργάτες δείχνει το πρόβλημα. Σε βιοϋμένια E. coli 24 ωρών πάνω σε γυαλί και σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών με φυσιολογικό ορό, περίπου 96% των κυττάρων εμφανίστηκαν θετικά στο ιωδιούχο προπίδιο in situ. Ωστόσο, οι συγγραφείς εκτίμησαν ότι 82% ήταν καλλιεργήσιμα μετά τη συλλογή. Οι συνεστιακές εικόνες έδειξαν κύτταρα με πράσινο εσωτερικό κάτω από υλικό που είχε χρωστεί κόκκινο, υποδεικνύοντας ότι εξωκυττάρια νουκλεϊκά οξέα συνέβαλαν στο παραπλανητικό σήμα.

Αυτά τα ποσοστά περιγράφουν διαφορετικές μετρήσεις στα παρασκευάσματα της μελέτης και όχι έναν καθολικό συντελεστή διόρθωσης. Το χρήσιμο συμπέρασμα είναι να ελέγχετε τι δημιούργησε το σήμα. Σε ένα βιοϋμένιο, μια χρωστική νουκλεϊκών οξέων μπορεί να ανιχνεύσει υλικό έξω από τα κύτταρα καθώς και μέσα σε κατεστραμμένα κύτταρα. Για συμπέρασμα σχετικά με τη βιωσιμότητα, οι ερευνητές συνιστούν συμπληρωματικές μετρήσεις, όπως καλλιέργεια ή μεταβολική δραστηριότητα, αναγνωρίζοντας παράλληλα ότι καθεμία έχει περιορισμούς.

Ελέγξτε τι περιέχει πραγματικά η εναλλακτική

Μια εναλλακτική μέθοδος χρώσης μπορεί να εξακολουθεί να περιέχει κυανό του μεθυλενίου. Η Giemsa αποτελεί παράδειγμα: η Merck περιγράφει το προϊόν της ως διάλυμα αζούρης-ηωσίνης-κυανού του μεθυλενίου, προοριζόμενο για εφαρμογές που περιλαμβάνουν επιχρίσματα αίματος και μυελού των οστών. Μπορεί να αποτελεί διαφορετική μέθοδο για διαφορετικό δείγμα, αλλά δεν ικανοποιεί μια απαίτηση αποκλεισμού του κυανού του μεθυλενίου.

Αν ο αποκλεισμός μιας ένωσης αποτελεί μέρος του πειράματος, ελέγξτε την ταυτότητα και τη σύνθεση του αντιδραστηρίου πριν συγκρίνετε εικόνες. Ο οδηγός για το methyl blue, το κυανό του μεθυλενίου και άλλες χρωστικές με παρόμοιες ονομασίες εξηγεί τις διαφορές στην ονοματολογία.

Επαληθεύστε την αντικατάσταση πριν χρησιμοποιήσετε το αποτέλεσμα

Για μια νέα μέθοδο, κάντε μια μικρή σύγκριση χρησιμοποιώντας αντιπροσωπευτικά δείγματα και κατάλληλο μάρτυρα. Διατηρήστε τις ρυθμίσεις του μικροσκοπίου συγκρίσιμες όπου είναι δυνατόν. Καταγράψτε τη σύνθεση του αντιδραστηρίου, την προετοιμασία του δείγματος, την έκθεση και τις συνθήκες απεικόνισης, ώστε μια εικόνα που φαίνεται καλύτερη να μπορεί να διερευνηθεί αντί απλώς να προτιμηθεί.

Αξιολογήστε την επιτυχία με βάση το αρχικό ερώτημα. Για τη μορφολογία, εξετάστε αν τα όρια και η διάταξη των κυττάρων παραμένουν ερμηνεύσιμα. Για την πυρηνική σήμανση, εξετάστε τη θέση του σήματος και το υπόβαθρο. Για τη βιωσιμότητα, απαιτήστε στοιχεία πέρα από έναν ελκυστικό χρωματικό διαχωρισμό. Ο ευρύτερος οδηγός για τη χρώση με κυανό του μεθυλενίου και τις εργαστηριακές εφαρμογές εξηγεί πώς συνδέονται η παρατήρηση και η προετοιμασία.

Επιλέξτε την εναλλακτική που διατηρεί τη μέτρηση που χρειάζεστε. Το χρώμα είναι μόνο μία ιδιότητα της εικόνας που προκύπτει.