Wer entwickelte die purpurrote Blutfärbung? Methylenblau, Malachowski, Romanowsky und Giemsa

Eosin ist rot. Methylenblau ist blau. Mischt man beide und trägt die Mischung auf einen getrockneten Blutausstrich auf, erscheinen Teile des Ausstrichs anschließend purpurrot.

Nicht alle Teile. In einem gelungenen Präparat nehmen die Kerne der weißen Blutkörperchen einen rotvioletten Farbton an. Im Inneren eines Malariaparasiten nimmt das Chromatin dieselbe Farbe an, während die umgebenden roten Blutkörperchen rosa und das Zytoplasma graublau bleiben. Der Purpurton macht die Zelltypen voneinander unterscheidbar.

Keine der beiden Flaschen enthält einen purpurroten Farbstoff. Die Farbe entsteht erst, wenn ein bestimmtes Abbauprodukt von Methylenblau auf dem Objektträger auf Eosin trifft. In den 1880er- und 1890er-Jahren wusste niemand, dass dieses Produkt existierte, geschweige denn, worum es sich handelte. Die Menschen, die dieser Farbe nachgingen, arbeiteten allein mit unreinen Farbstoffen. Sie hatten keine verlässliche Möglichkeit festzustellen, was eine Flasche enthielt, nachdem sie zwei Monate im Regal gestanden hatte.

Deshalb gibt es auf die Frage im Titel mehr als eine vertretbare Antwort, und deshalb änderte sich die Antwort im Jahr 2011.

Was sichtbar wurde, änderte sich mit der Mischung

Die Färbung wurde nicht erfunden. Sie entstand Schritt für Schritt. Jede Änderung der Mischung lieferte genau eine neue sichtbare Information. Die Abfolge dieser Informationen macht die Geschichte am verständlichsten.

Entscheidend ist das Muster in der letzten Spalte. Jeder Fortschritt erweiterte das Farbspektrum, und jede Erweiterung machte eine weitere Struktur sichtbar. Der Purpurton ist kein dekorativer Zusatz zur Technik; er macht den Unterschied zwischen dem Erkennen eines vorhandenen Parasiten und dem Erkennen seiner Bestandteile aus. Wie der Farbstoff selbst aus einem BASF-Farbenwerk in die Medizin gelangte, ist eine längere Geschichte mit eigenen Dokumenten. Die vollständige Abfolge oben, mit einer Quelle für jeden Eintrag, ist als Chronologie der Mitwirkenden mit Quellenverweisen dokumentiert.

Abbildung: dieselben sechs Mischungen, dargestellt anhand dessen, was in der Schale war und was daraus entstand. Die Kreise zeigen die Farbstoffe; die Blöcke darunter zeigen die Farben, die diese Farbstoffe in einem Blutausstrich erzeugen konnten. Vor 1890 erscheint kein rotvioletter Block, danach fehlt er in keiner Mischung.

Der Mann, der Borax gezielt einsetzte

Ernst Malachowski war Arzt in Breslau, dem heutigen Wrocław. Er arbeitete während seiner Laufbahn in einer Privatpraxis und einer kleinen Klinik, die er mit einem Kollegen betrieb, und führte in seiner freien Zeit Laborarbeiten durch. Er wurde am 12. März 1857 in Strzelno geboren, studierte Medizin an der Universität Breslau und arbeitete von 1882 bis 1887 als Assistenzarzt in der Inneren Medizin am Allerheiligenhospital, damals dem zweitgrößten Krankenhaus Deutschlands.

Er begann 1888 mit der Doppelfärbung von Chęciński und Plehn. In einem 1889 angefertigten Präparat sah er, dass sich das Chromatin des Plasmodienkerns anders färbte als das Zytoplasma. Anschließend konnte er das Ergebnis nicht reproduzieren. Er versuchte, das Methylenblau anzusäuern, was das Ergebnis verschlechterte. Er versuchte, es mit Borax zu alkalisieren, was jedes Mal funktionierte. Am 15. Juni 1890 führte er die Methode öffentlich vor und veröffentlichte im August 1891 eine ausführlichere Beschreibung einschließlich der Anweisung zur Verwendung von Borax. Er vermerkte, dass die Färbung vierundzwanzig Stunden dauerte und die Ergebnisse leicht reproduzierbar waren.

Vierundzwanzig Stunden sind in einem diagnostischen Labor eine lange Zeit, und sein Artikel ging nicht ausführlich auf die purpurrote Farbe des Parasitenkerns ein. Was auch immer der Grund war: Niemand griff die gezielte Alkalisierung von Methylenblau auf, bis Nocht sie 1898 erneut durchführte. Malachowski schrieb nie wieder über die Blutfärbung.

Dass bis vor Kurzem so wenig über ihn bekannt war, liegt an der Quellenlage und ist kein Rätsel. In der medizinischen Literatur blieben fast keine Spuren seines Lebens erhalten, und das, was erhalten blieb, gelangte über einen einzigen Weg zu uns. Seine Tochter Marie verließ Deutschland 1939 in Richtung London, diente in der britischen Armee und ließ sich in Kanada nieder. Ihre Sammlung von Familienunterlagen gelangte schließlich an das Leo Baeck Institute in New York. Ihr Bruder Leo fiel im Ersten Weltkrieg. Ihre Schwester Eva wurde im April 1942 von Breslau in das Durchgangslager Izbica deportiert und kehrte nie zurück. Ihre Mutter Hedwig nahm sich am 22. April 1942 das Leben, statt dieselbe Deportation abzuwarten. Malachowski war bereits 1934 gestorben, bevor all dies geschah.

Eine Familiengeschichte, die so endet, ist eine Familiengeschichte, auf die irgendwann niemand mehr verweist. Die beiden Artikel, die Malachowski wieder in die Entwicklungsgeschichte der Färbung einordneten, erschienen 2011. Sie wurden auf Grundlage von Archivdokumenten in Poznań und Wrocław sowie Maries Unterlagen in New York erarbeitet.

Eine verschimmelte Flasche und ein Russe mit Glück

Dmitri Romanowsky studierte Medizin an der Militärmedizinischen Akademie in Sankt Petersburg und beschäftigte sich während des größten Teils seiner Laufbahn mit Malaria. 1890 veröffentlichte er eine Methode, die auf dem Papier nahezu identisch mit der von Chęciński war: unverändertes Methylenblau und Eosin, mit etwas mehr Eosin.

Im September 1891 veröffentlichte er die Methode, die seinen Namen bekannt machte. Das entscheidende Detail war in den Anweisungen verborgen. Seine besten Ergebnisse erzielte er mit die vorräthige Methylenlösung, einer Vorratslösung von Methylenblau, die über zwei Monate gestanden hatte und auf der Schimmel gewachsen war. Der Schimmel und die Standzeit hatten den Farbstoff teilweise demethyliert. Romanowsky wusste das nicht und konnte es nicht steuern. Andere Forscher, die seine Methode ausprobierten, konnten den Purpurton nicht erzielen. Seine Dissertation war im Juni 1891 in Sankt Petersburg eingereicht worden. Deshalb gilt 1891 in der üblichen Darstellung als das Jahr der Entdeckung.

Malachowskis Vorführung hatte im Juni 1890 stattgefunden, mehr als ein Jahr früher, und seine Methode erzeugte das Ergebnis gezielt.

Warum der falsche Mann zum Namensgeber wurde

Kristine Krafts, Ernst Hempelmann und Barbara Oleksyn trugen die Argumente für Malachowski zusammen. Sie beruhen auf vier Punkten. Dem Datum der öffentlichen Vorführung: Juni 1890 gegenüber September 1891. Dem Wort gezielt gegenüber dem Wort zufällig. Der Tatsache, dass Malachowski seine Methode samt Borax veröffentlichte, während Romanowskys Methode von einer unkontrollierten Variablen abhing. Und der Beobachtung, dass die Beschreibung des Plasmodienkerns samt dem Purpurton, der ihn sichtbar machte, praktisch sieben Jahre lang aus der Literatur verschwand, weil niemand die zufällig entstandene Variante reproduzieren konnte.

Ihre Schlussfolgerung formulieren sie unverblümt. Im biografischen Artikel nennen sie die Zuschreibung „eine Farce“ und zitieren Ralph Lillie, der 1978 schrieb, „vielleicht sollten wir diese Familie von Färbungen als Malachowski-Färbungen bezeichnen“.

Der Anspruch ist umstritten, wie Prioritätsansprüche es meist sind. Es lohnt sich, die Streitfrage zu erläutern, statt sie zu entscheiden. Eine Auseinandersetzung über Priorität muss benennen, worin die Entdeckung bestand. Wenn die Entdeckung der Purpurton ist, hat Malachowski die frühere dokumentierte Vorführung vorzuweisen. Wenn die Entdeckung die veröffentlichte Methode ist, veröffentlichten beide Männer 1891, und Romanowsky wurde zum Namensgeber. Wenn die Entdeckung die Erklärung ist, kann keiner der beiden einen Anspruch erheben. Denn keiner wusste, dass die Reifung eine Demethylierung war, und keiner konnte sagen, warum die Farbe überhaupt entstand. Diesen letzten Punkt lassen populäre Darstellungen aus. Der entscheidende Bestandteil war eine Verunreinigung, die niemand identifiziert hatte. Der erste Mensch, der die Farbe gezielt erzeugte, tat dies mithilfe einer reproduzierbaren empirischen Rezeptur, nicht aufgrund eines Verständnisses ihrer Wirkungsweise.

Die beiden Artikel von 2011 sind die umfassendste veröffentlichte Darlegung der Argumente für Malachowski. Beide sind über PubMed frei zugänglich: die ausführliche Übersichtsarbeit unter PMID 21235291 und der biografische Artikel unter PMID 21660627. Der PubMed-Eintrag zur Übersichtsarbeit führt außerdem einen Kommentar dazu auf, der später im selben Jahr in derselben Zeitschrift unter 86(5):366 erschien. Das erinnert zu Recht daran, dass die Argumentation bereits unmittelbar nach ihrem Erscheinen in der Fachliteratur angefochten wurde.

Der Streit betrifft keine chemischen Fragen. Alle Beteiligten sind sich einig, was der Purpurton ist und welche Bestandteile ihn erzeugen. Die Meinungsverschiedenheit betrifft die Frage, wer ihn zuerst erzeugte und ob ein Zufall, den niemand reproduzieren konnte, überhaupt als Erreichen dieses Ziels zählt.

Was die späteren Namen beitrugen

Wenn Malachowski den Purpurton zuerst erzeugte, warum trägt die Färbung dann die Namen von Romanowsky, Wright und Giemsa?

Weil eine Färbung, die in den Händen ihres Erfinders einmal funktioniert, noch kein Reagenz ist. Die späteren Arbeiten machten aus einer unberechenbaren Mischung etwas, das eine Laborfachkraft in einem anderen Land an einem beliebigen Dienstag verwenden konnte.

Nocht gelang dies durch Schlussfolgerungen. Nachdem er mit einem einfachen neutralen Farbstoff kein verlässliches Ergebnis erzielt hatte, folgerte er, dass der Purpurton von etwas im Methylenblau stammen musste, das selbst kein Methylenblau war, und machte sich auf die Suche. Unna hatte bereits bemerkt, dass gealterte Methylenblaulösungen Mastzellgranula rot färbten, und vermutet, dass bei der Reifung des Farbstoffs eine neue Substanz entstand. Bernthsen hatte 1885 gezeigt, dass alkalische Bedingungen Methylgruppen von Methylenblau abspalten und dass diese Produkte das sind, was wir heute als Azurfarbstoffe bezeichnen. Nocht extrahierte die aktive Fraktion mit Chloroform und konnte sie nur Rot aus Methylenblau nennen; Michaelis gab ihr 1901 den Namen Azur I. Jenner löste die logistischen Probleme. Durch erneutes Auflösen des Methylenblau-Eosin-Niederschlags in absolutem Methanol entstand eine einzige stabile Lösung, die den Ausstrich während der Färbung fixierte und die Hitzefixierung überflüssig machte. Leishman und Reuter kombinierten polychromierten Farbstoff mit einem alkoholischen Lösungsmittel und erzielten damit sowohl Stabilität als auch den Purpurton. Wright ersetzte eine zwölfstündige Inkubation bei 65 °C und zehn Tage Standzeit durch eine Stunde in strömendem Wasserdampf. Giemsa verzichtete vollständig auf eine zufällig gereifte Lösung. Er verwendete abgemessene Mengen bekannter Farbstoffe und setzte dem Methanol Glycerin zu, damit das Produkt tropischer Hitze standhielt. Er veröffentlichte nie, wie er reines Methylenazur herstellte. Er verkaufte es an das Labor von Dr. Grübler in Leipzig, das es als Azur I vermarktete und behauptete, nur seine Variante sei eine authentische Giemsa-Färbung.

Die Identität dieses Azurs ist bis heute umstritten. Manche halten es schlicht für polychromiertes Methylenblau, andere für eine Mischung mit hohem Anteil an Azure B. Die Antwort ergab sich aus einem Krieg. Als deutsche Farbstoffe nicht mehr erhältlich waren, stellte ein Team des United States Public Health Service, Ralph Lillie mit Maurice Roe und Aimee Wilcox, fest, dass drei getrennte Bestandteile die beste Färbung ergaben: unverändertes Methylenblau, sein demethyliertes Abbauprodukt Azure B und Eosin. Azure B ersetzte das nicht verfügbare Azur I. Diese drei Bestandteile bilden bis heute die Grundlage der Färbung, die zur Diagnose von Malaria verwendet wird.

Die Chemie des Zusammenspiels dieser drei Bestandteile auf einem Objektträger ist eine eigene Frage und wird auf einer anderen Seite behandelt. Der Artikel über die Rollen der Farbstoffe und die Chemie von Romanowsky-Färbungen erläutert, was Azure B und Eosin jeweils bewirken und warum das Paar eine Farbe erzeugt, die keiner der beiden allein erzeugt. Die Seite über Mikroskopie und Laboranwendungen behandelt die praktische Seite: was ein bestimmtes Präparat zeigt und wie sich beurteilen lässt, ob ein bestimmtes Produkt für die vorgesehene Methode geeignet ist.

Der Teil der Geschichte, der bis heute aktuell ist

Ein Detail dieser Geschichte blieb auch nach 1902 wahr. Rund fünfzig Jahre lang war der wichtigste Bestandteil der weltweit üblichen Malariafärbung eine unbenannte Verunreinigung. Sie war zufällig vorhanden, ihre Menge schwankte von Flasche zu Flasche, ihre Identität war zeitweise ein Geschäftsgeheimnis, und über ihren Anteil wurde bis in die 1940er-Jahre gestritten. Die Menschen, die die Färbung verwendeten, waren nicht nachlässig. Sie hatten keine Möglichkeit zu wissen, was in der Flasche war.

Die heutige Variante desselben Problems ist eine Spezifikation, die nur einen Teil des Materials beschreibt. Die Konformität mit USP ist der Weg zur höchsten auf dem Markt angebotenen Reinheit, weil dahinter ein vollständiger veröffentlichter Standard steht und keine einzelne Messung: Identität, Reinheit, organische Verunreinigungen einschließlich der Azurfarbstoffe, Restlösungsmittel, elementare Verunreinigungen, Glührückstand, mikrobiologische Grenzwerte und bakterielle Endotoxine. Blupreme bezieht sein Methylenblau von einem pharmazeutischen Hersteller und veröffentlicht das vollständige Analysezertifikat, sodass sich jeder Punkt dieser Liste überprüfen lässt, statt nur behauptet zu werden. Ein Zertifikat, das ein Schwermetallergebnis angibt und dies als USP-Konformität bezeichnet, ist das heutige Gegenstück zu einer Flasche mit der Aufschrift „gereiftes Methylenblau“: möglicherweise ein gutes Reagenz, doch das Etikett sagt nicht, was darin enthalten ist.