E. coli und andere Kolonieformen auf EMB-Agar beurteilen

Ein Student streicht eine unbekannte Probe auf Eosin-Methylenblau-Agar aus, inkubiert sie über Nacht und findet anschließend eine Platte mit dunklen Kolonien und grünem Schimmer vor. Im Laborbuch steht „E. coli, bestätigt“. Dieser Eintrag behauptet mehr, als die Platte belegen kann. Die Platte zeigt einen Wachstums- und Fermentationsphänotyp unter bestimmten Bedingungen. Die Identität der Spezies ist eine eigenständige Aussage, die eigene Nachweise erfordert.

Dieser Leitfaden behandelt EMB-Agar-Ergebnisse als Interpretationsaufgabe. Er erläutert das zugrunde liegende Prinzip, führt durch einen beispielhaften Plattenatlas mit Kontrollen und beschreibt Fälle, in denen das Lehrbuchbild in die Irre führt.

Das Prinzip hinter der Platte

EMB-Agar ist sowohl selektiv als auch differenziell. Die Farbstoffe Eosin Y und Methylenblau hemmen viele grampositive Organismen, sodass das Medium das Wachstum gramnegativer Organismen begünstigt. Dieselben Farbstoffe dienen als Indikatoren: Wenn ein Organismus den verfügbaren Zucker fermentiert und dabei lokal genügend Säure bildet, nimmt die Kolonie viel Farbstoff auf und färbt sich dunkelviolett bis blauschwarz. Bei starker Säurebildung kann die Kolonieoberfläche einen metallisch grünen Schimmer zeigen. Das ASM-Protokoll für Eosin-Methylenblau-Agarplatten beschreibt diese Kombination aus Selektion und Differenzierung und stellt Referenzfotografien für die Lehre bereit.

Vor der Beurteilung eines Ergebnisses ist ein Detail entscheidend: Prüfen Sie, welche Rezeptur verwendet wird. Die ältere Holt-Harris-Teague-Rezeptur enthält Lactose und Saccharose, während Levine-EMB nur Lactose enthält. Ein Organismus, der Saccharose, aber keine Lactose fermentiert, etwa viele Serratia-marcescens-Isolate, kann auf den beiden Varianten unterschiedlich aussehen. Die Herstellerdokumentation zu EMB-Medien nennt diesen Rezepturunterschied ausdrücklich. Dokumentieren Sie Hersteller und Rezeptur zusammen mit dem Ergebnis im Laborbuch.

Zubereiteter, unbeimpfter EMB-Agar ist typischerweise rotbraun bis rötlich violett, gelegentlich mit einem grünlichen Stich oder feinem Präzipitat. Diese Hintergrundfarbe ist kein Wachstum. Vergleichen Sie jeden Befund mit einer unbeimpften Platte oder dem dokumentierten Ausgangszustand. Beurteilen Sie die Primärplatte nach etwa 18 bis 24 Stunden aerober Inkubation bei 35 bis 37 C, sofern das Lehrprotokoll nichts anderes vorgibt. Eine längere Inkubation kann das Erscheinungsbild der Fermentation verändern.

So betrachten Sie die Platte

Nutzen Sie zwei Beleuchtungsarten. Betrachten Sie die Platte zunächst bei Auflicht oder schrägem Lichteinfall und neigen Sie sie: Der metallische Glanz ist irisierend und kann je nach Betrachtungswinkel erscheinen oder verschwinden. Untersuchen Sie die Platte anschließend im Durchlicht, um die Koloniefarbe und dunkle Zentren zu beurteilen. Gehen Sie von gut isolierten Kolonien aus, da dichtes Wachstum und benachbarte Kolonien die lokale Säureanreicherung verändern und die Färbung abschwächen oder verstärken können. Die ASM-Bildsammlung zeigt dies unmittelbar: E. coli kann in einer Mischkultur den erwarteten Glanz verlieren, weil umgebende Organismen das Säuremilieu verändern.

Führen Sie Kontrollen mit, soweit die Übung dies zulässt. Ein gängiger Kontrollsatz für die Lehre umfasst E. coli ATCC 25922 für den blauschwarzen Phänotyp mit metallischem Glanz, einen Nichtfermentierer wie Salmonella Typhimurium ATCC 14028 oder Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 für den farblosen Phänotyp sowie einen grampositiven Organismus wie Enterococcus faecalis oder Staphylococcus aureus als Hemmkontrolle, wie in den Standardtabellen zur Qualitätskontrolle von EMB-Medien aufgeführt. Wenn die Positivkontrolle keinen Glanz zeigt, prüfen Sie zunächst Inkubation, Wachstumsdichte und Rezeptur, bevor Sie die unbekannte Probe als Ursache ansehen.

Beispielhafter Plattenatlas

Die folgenden Platten sind generierte Illustrationen, keine Fotografien realer Kulturen. Sie zeigen das gesuchte Muster, nicht den genauen Farbton eines bestimmten Stamms. Vergleichen Sie sie mit den ASM-Referenzfotografien und mit realen Platten aus dem Lehrlabor.

Platte 1: Escherichia coli auf EMB-Agar, starker Lactosefermentierer

E. coli ist auf EMB-Agar typischerweise dunkelviolett bis blauschwarz, häufig mit einem dunklen Zentrum und einem metallisch grünen Glanz infolge starker Säurebildung. Dieser Glanz ist der bekannte Befund, nach dem Studierende suchen. Behandeln Sie ihn jedoch als unterstützenden Hinweis und nicht als Definitionsmerkmal. Die Intensität des Glanzes variiert mit Stamm, Inkubationsdauer, Koloniedichte und Betrachtungswinkel. Fehlender Glanz schließt E. coli nicht aus, und eine dunkle Kolonie ohne Glanz kommt bei mehreren anderen Fermentierern vor. Wählen Sie für weiterführende Untersuchungen eine gut isolierte Kolonie aus, statt einen dicht bewachsenen Sektor zu beurteilen.

Platte 2: Klebsiella pneumoniae auf EMB-Agar, schleimiger Fermentierer

Klebsiella pneumoniae bildet auf EMB-Agar typischerweise große, glänzende, schleimige Kolonien in rosa-violetten bis braun-violetten Farbtönen, häufig mit dunklen Zentren, aber meist ohne ausgeprägten metallischen Glanz. Eine ähnliche Morphologie tritt bei verwandten Fermentierern wie Enterobacter auf. Schleimige Beschaffenheit und Koloniegröße gehören zur Beurteilung: Eine kleine, flache rosa Kolonie hat eine andere Aussagekraft als eine große, gewölbte, schleimige Kolonie. Wie bei E. coli liefert die Platte einen Hinweis auf einen Fermentationsphänotyp. Eine Benennung auf Speziesebene erfordert die unten beschriebene biochemische Bestätigung.

Platte 3: Salmonella auf EMB-Agar und andere Nichtfermentierer, farblose Kolonien

Salmonella und ähnliche Organismen, die keine Lactose fermentieren, darunter Shigella und viele Pseudomonas-Isolate, wachsen auf EMB-Agar typischerweise als farblose bis durchscheinende oder blass bernsteinfarbene Kolonien. Manche Rezepturen und Bedingungen führen zu einem schwachen rosa Farbstich. Eine blassrosa Kolonie ist daher nicht automatisch ein Fermentierer. EMB unterscheidet Salmonella weder von Shigella noch von anderen Nichtfermentierern; diese Unterscheidung erfolgt durch nachfolgende Tests. Beachten Sie außerdem, dass lactosepositive Salmonella-Stämme mit metallisch glänzenden, E. coli ähnlichen Kolonien dokumentiert wurden. Dies ist ein weiterer Grund, weshalb eine einzelne Platte keine abschließende Identifizierung erlaubt.

Platte 4: Serratia marcescens und die Rezepturfalle

Serratia marcescens erhält einen eigenen Abschnitt, weil Studierende häufig rote Kolonien erwarten und die Platte anschließend falsch beurteilen. Die meisten klinischen Isolate fermentieren keine Lactose und erscheinen daher auf Levine-EMB häufig blass bis schwach gefärbt. Da viele Isolate Saccharose fermentieren, kann eine saccharosehaltige Rezeptur eine dunklere Färbung oder eine stärker säurebedingte Reaktion ergeben. Erwarten Sie bei 35 bis 37 C auch nicht das klassische rote Prodigiosin-Pigment; die Pigmentbildung ist bei Inkubatortemperatur unzuverlässig. Wenn ein Protokoll Serratia marcescens auf EMB-Agar beschreibt, prüfen Sie, welche Rezeptur der Aussage zugrunde liegt. Eine Übersichtsarbeit zum Stoffwechsel von Serratia fasst das lactosenegative und hinsichtlich der Saccharosefermentation variable Muster zusammen, das hinter dieser Falle steht.

Platte 5: Kontrollen und gehemmte Organismen

Grampositive Organismen wie Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus und Bacillus werden auf EMB-Agar im Allgemeinen gehemmt oder deutlich im Wachstum unterdrückt. Die Hemmung ist jedoch nicht bei jedem Stamm vollständig. Ein Kontrollsatz ermöglicht eine belastbare Beurteilung: Die E.-coli-Kontrolle sollte gutes Wachstum mit blauschwarzer Färbung und Glanz zeigen, die Nichtfermentierer-Kontrolle farbloses Wachstum und die Hemmkontrolle wenig oder kein Wachstum. Wenn die Hemmkontrolle gut wächst, hat die Selektion nicht funktioniert, und alle anderen Befunde dieser Charge sind fragwürdig. Färbemethoden beantworten eine andere Frage als Kulturmedien. Informationen zur Färbung von Objektträgerpräparaten finden Sie im Atlas zur Methylenblau-Färbung.

Vergleich mit begrenzter Aussagekraft

Drei Sätze fassen die irreführenden Erscheinungsbilder zusammen. Dunkel bedeutet nicht E. coli, da Klebsiella, Enterobacter und andere Fermentierer dunkle Zentren ohne Glanz entwickeln. Rosa bedeutet nicht Klebsiella, da mäßige oder langsame Fermentierer und manche üblicherweise als Nichtfermentierer eingeordneten Organismen rosa oder lavendelfarben erscheinen. Glanz bedeutet keinen eindeutigen Nachweis von E. coli, da auch andere starke Fermentierer ihn erzeugen können. Das Lehrprotokoll und seine Abbildungen von Mischkulturen veranschaulichen jede dieser Fehlinterpretationen.

Grenzen der Bestätigung

EMB-Agar zeigt einen Phänotyp, keine Spezies. Verschiedene Organismen können dasselbe Kolonieerscheinungsbild aufweisen. Zugleich kann ein Organismus abhängig von Stamm, Alter, Wachstumsdichte, Rezeptur und Inkubation von seinem Lehrbuchbild abweichen. Deshalb gilt die EMB-Morphologie in Lehr- und klinischen Arbeitsabläufen als vorläufiger Hinweis.

Ein fachlich vertretbarer Arbeitsablauf für Studierende ist: die isolierte Kolonie beschreiben (Größe, Farbe, Zentrum, Glanz bei schrägem Lichteinfall, schleimige Beschaffenheit), Rezeptur, Inkubationsdauer und -temperatur sowie Kontrollen dokumentieren; anschließend eine gut isolierte Kolonie vor jedem Bestätigungstest zur Gewinnung einer Reinkultur subkultivieren. Zu den gängigen Folgeuntersuchungen gehören Gramfärbung und IMViC-Reaktionen zur vorläufigen Identifizierung von E. coli und coliformen Bakterien sowie TSI oder KIA und organismusspezifische biochemische Testkombinationen für enterische Organismen. Je nach Aufgabenstellung kommen serologische Verfahren, MALDI TOF oder andere validierte Identifizierungsverfahren hinzu. Hintergrundinformationen zur Einordnung von EMB unter den selektiven und differenziellen Medien für enterische Organismen finden Sie in Einführungen zu entsprechenden Kulturmedien und unter Gramfärbung als Folgeuntersuchung. Für die verwandte Frage, was eine blaue Färbung auf einem Objektträger belegen kann und was nicht, trennt der Atlas zur Methylenblau-Färbung Beobachtung und Schlussfolgerung nach demselben Prinzip.

Notieren Sie die Beobachtung vor der Schlussfolgerung. „Dunkle blauschwarze Kolonien mit winkelabhängigem grünem Glanz auf Levine-EMB nach 24 Stunden, vereinbar mit starker Lactosefermentation“ ist fachlich vertretbar. „E. coli, bestätigt“ erfordert den Bestätigungsschritt, den die Platte allein nicht leisten kann.