Paul Ehrlich og methylenblåt: hvordan et farvestof var med til at forme lægemiddeludviklingen

Paul Ehrlichs bidrag til lægevidenskaben var ikke et lægemiddel. Det var et ræsonnement om, hvordan man skulle undersøge et.

I 1878 indleverede han en doktorafhandling, hvis indledende afsnit havde titlen "Den kemiske forståelse af farvning." Argumentet var, at farvning af et vævssnit og farvning af et stykke stof følger samme logik. I begge tilfælde binder farven sig på grund af en kemisk affinitet mellem farvestoffet og materialet, ikke fordi vævet er absorberende, fedtholdigt eller formet til at indfange et pigment. Ehrlich var vokset op med at se sin fætter, patologen Karl Weigert, fremstille farvede vævssnit, og det, der fangede hans opmærksomhed, var ikke billederne, men at farvestoffet valgte, hvor det skulle hen.

Påstanden lyder beskeden. Det er den ikke. Hvis et farvestof binder sig til et væv af kemiske årsager, er farvningsmønstret en rapport om vævets kemi. Et farvet objektglas ophører med at være en illustration og bliver en måling.

Han byggede straks videre på det. I 1880 kombinerede han methylenblåt med sur fuksin og kaldte blandingen et neutralt farvestof, et neutralt farvelegeme, som adskilte de forskellige typer hvide blodlegemer, hvor de enkelte farvestoffer, der dengang var i brug, ikke kunne. To år senere fremlagde han en metode med methylviolet til farvning af tuberkelbaciller, og Koch tog proceduren i brug i sit eget arbejde.

Den teori, der senere gav disse fremgangsmåder et fælles grundlag, er en særskilt sag, og dens datering bliver ofte udvisket. Ehrlichs sidekædeteori, idéen om, at et stof virker på en celle, fordi de to er kemisk kompatible, hører til i 1890'erne, ikke i årene med farvestofforsøgene. Det tidligere arbejde leverede den forudgående overbevisning: selektivitet er kemisk, og derfor kan man lede efter selektivitet i stedet for at falde over den.

Forsøget, der gjorde farvestoffet til et kort

I 1885 udgav Ehrlich en monografi om organismens iltbehov med undertitlen en farveanalytisk undersøgelse. Metoden bestod i at injicere farvestoffer, hvis farve afhænger af oxidationstilstanden, og derefter sammenligne, hvordan forskellige organer reducerede dem eller bevarede dem uændrede. Farvestoffet blev brugt som et instrument på samme måde som et termometer: det gav oplysninger om forhold inde i vævet, som ikke kunne undersøges direkte. Ehrlich beskrev selv formålet som at bestemme levende organers reduktionsevne ved hjælp af bestemte farvestoffer.

Resultatet med methylenblåt kom i 1886 i en artikel om farvestoffets reaktion med levende nervesubstans, der var blevet læst op for et lægeselskab den foregående december. Methylenblåt blev indført i kredsløbet hos et levende dyr, hvorefter tynde vævssnit blev udtaget og udsat for luft, så ophobet farveløst farvestof blev oxideret tilbage til blåt og viste, hvor det havde samlet sig. Nerveceller og nervefibre tog farven til sig, og det skete så selektivt, at teknikken blev en standardmetode til at synliggøre nervevæv. Forbindelsen var ikke længere blot et farvestof, der blev påført et dødt vævssnit på et laboratoriebord. Den var en markør, som fordelte sig inde i en levende krop, og fordelingen kunne aflæses.

Den egenskab, der ligger til grund for begge forsøg, fortjener at blive beskrevet klart, for alt andet i denne historie afhænger af den. Methylenblåts omdannelse er reversibel. Dets reducerede form, leucomethylenblåt, er farveløs, og ved kontakt med ilt vender det tilbage til den blå kation. En glukoseopløsning med farvestoffet i en lukket beholder er farveløs; åbner man beholderen, bliver den blå. Ehrlich skal have demonstreret dette direkte ved at behandle farvede vævssnit med jernchlorid såvel som luft og se farven vende tilbage. Et farvestof, der skifter farve med omgivelsernes redoxtilstand, er en sonde til at undersøge disse omgivelser.

Dermed stod to egenskaber side om side. Et farvestof kunne skelne mellem forskellige væv. Og et farvestof kunne tændes og slukkes ved en ændring i oxidationstilstanden.

Set bagud er den anden egenskab begyndelsen på kemoterapi. Hvis en forbindelse binder sig til én type væv og ikke en anden, kan den samme forbindelse måske nå én type organisme og ikke en anden. Ehrlich formulerede slutningen direkte: hvis et patogen kunne farves selektivt, kunne farvningen være tegn på en specifik skadevirkning på det patogen. Et farvestof kunne derfor måske bruges som lægemiddel, rettet mod en indtrænger frem for mod patienten.

Den første afprøvning hos en patient gjaldt ikke malaria. I 1890 rapporterede Ehrlich sammen med psykiateren Arthur Leppmann, at methylenblåt lindrede smerter ved neuralgiske og reumatiske tilstande i muskler, led og sener. De to mænd drøftede, om lægemidlet kunne virke på psykisk sygdom, og besluttede ikke at afprøve det. En italiensk læge, Pietro Bodoni fra Genova, gik alligevel videre. Titlen på hans artikel fra 1899 henviser til en beroligende virkning ved forskellige former for psykose: han beskrev en beroligende effekt hos fjorten urolige patienter og bemærkede, at andre læger i Genova allerede brugte farvestoffet til samme formål. Sedation er ikke en virkning på sygdommen, og det er en skelnen, der bliver ved med at dukke op i denne historie.

Arbejdet med malaria kom i 1891 sammen med patologen Paul Guttmann på Moabit-hospitalet i Berlin. Methylenblåt blev givet til to patienter, og rapporten udkom i Berliner klinische Wochenschrift den 28. september 1891. I det første tilfælde tog patienten 0.5 g af farvestoffet på én gang om aftenen den 29. juni; det forventede anfald udviklede sig ikke fuldt ud, og den eneste gene, der blev registreret bagefter, var let stranguri med blå urin. Feberanfaldene forsvandt i løbet af de første dage, og parasitterne var væk fra blodet senest på ottendedagen. Forfatternes egen sammenfatning var, at deres forventninger var blevet fuldt indfriet. To ukontrollerede tilfælde er ikke et bevis. Den mere udførlige gennemgang af methylenblåt og malaria, herunder de moderne forsøg, hører hjemme på sin egen side, og det interessante spørgsmål her er snævrere: hvor meget af Ehrlichs ræsonnement holdt ved mødet med parasitten.

Hvor ræsonnementet holdt, og hvor det svigtede

Ikke meget af mekanismen holdt, i hvert fald ikke i den form, Ehrlich foreslog. Den enkle forklaring, hvor en flad tricyklisk kation glider ind mellem baseparrene i parasittens DNA, holder ikke for Plasmodium. Methylenblåt reduceres så let af en inficeret rød blodcelle, at det slet ikke når frem til parasitten som en plan kation, og interkalationsforklaringen, der passer på akridinfarvestofferne, passer ikke på dette stof.

Det, evidensen understøtter, er mindre enkelt. Methylenblåt hæmmer parasittens glutathionreduktase ved koncentrationer, der kan opnås hos en patient. Det blokerer omdannelsen af hæm til hæmozoin, det inerte pigment, parasitten danner for at undgå at blive forgiftet af sin egen nedbrydning af hæmoglobin, omtrent lige så effektivt som klorokin og langt mere effektivt end kinin. Dets redoxcyklus danner også reaktive iltforbindelser i en celle, der allerede producerer dem. Hvilken af disse mekanismer der er den egentlige, eller om de alle bidrager, er stadig ikke afklaret.

Der er endnu en komplikation, og den bør præge læsningen af enhver historisk påstand om denne forbindelse. Datidens kommercielle methylenblåt var ikke ét enkelt stof. Prøver indeholdt azure B, den monodemethylerede beslægtede forbindelse, og ældre opløsninger ophobede mere af den. Azure B er et metakromatisk farvestof med andre mål: det farver dobbeltstrenget DNA dybblåt og RNA grønt. En blanding af to farvestoffer med forskellige bestemmelsessteder, i forhold som ingen registrerede, kan ikke understøtte en entydig udtalelse om, hvad methylenblåt i blandingen gjorde.

Selve farvestoffet fortrængte aldrig kinin. Metoden klarede sig bedre. Ehrlichs elev Wilhelm Roehl, der arbejdede for farvestof- og lægemiddelkoncernen IG Farben, fortsatte med at fremme farvestofderivater som lægemidler mod tropesygdomme og leverede det manglende værktøj: kanariefuglen, inficeret med fuglemalaria, som en rutinemæssig screeningsmodel for kandidatforbindelser. Werner Schulemann ændrede derefter sidekæden, og det resulterende fenothiaziniumsalt helbredte den eksperimentelle infektion. Det gjorde stadig patienterne blå.

Det blivende resultat viste sig hverken at være farvestoffet eller ringsystemet, men sidekæden. Tilføjelsen af en dialkylaminoalkylaminogruppe ændrede molekylets opførsel, og fragmentet overlevede alle senere omarbejdninger. Beholder man den gruppe og erstatter fenothiaziniumringen med en akridinring, er resultatet kinacrin. Indsætter man en kinolinring i stedet, er resultatet klorokin. Pamakin, primakin og amodiakin, der alle stadig findes blandt malariamidlerne, har den samme gruppe. Den forbindelse, der slog fejl som behandling, leverede den del, der lykkedes.

Forbindelsen til antipsykotika går gennem ringen snarere end gennem lægemidlet. Opklaringen af methylenblåts struktur førte Heinrich August Bernthsen til den grundlæggende fenothiazinkerne i 1883, og det var denne grundstruktur, med forskellige substitutioner, kemikerne hos Rhône-Poulenc arbejdede med i 1940'erne, mens de ledte efter antihistaminer. En af disse forbindelser blev syntetiseret omkring slutningen af 1950 og afprøvet af kirurgen Henri Laborit, som bemærkede, at den gjorde patienterne rolige og ligeglade. Den første publicerede psykiatriske anvendelse, hos en patient med mani, kom i januar 1952. Det første antipsykotikum er ikke så meget en efterkommer af Ehrlichs malariamiddel som en fjern slægtning til det farvestof, han begyndte med.

Tre vaner, der er værd at tage med fra denne historie

1. "Det første syntetiske lægemiddel anvendt i lægevidenskaben" beskriver en kategori, og forbeholdene er større, end formuleringen antyder. Udtrykket er blevet en fast vending; en ofte citeret oversigtsartikel af Schirmer og kolleger i Neurobiology of Aging kalder methylenblåt det allerførste fuldt syntetiske lægemiddel anvendt i lægevidenskaben. Chloralhydrat blev introduceret som et syntetisk beroligende middel i 1869, mere end tyve år tidligere. Artiklen fra 1891 giver selv en del af svaret, fordi forfatterne nævner de syntetiske febernedsættende midler, der allerede havde slået fejl mod malaria, blandt andet kinolin, antipyrin og antifebrin. Ehrlichs eget arsenholdige middel mod syfilis kom endnu senere. Den forsvarlige version af påstanden handler om metode snarere end om at være først: methylenblåt er blandt de tidligste syntetiske forbindelser, som blev valgt til at virke mod en bestemt organisme på grundlag af en kemisk teori om selektivitet.
2. Selektiv fordeling er ikke selektiv gavn. Ehrlichs resultat fra 1886 var, at farvestoffet når frem til nervevæv. Hvor en forbindelse ender, og hvad den gør, når den når frem, er to forskellige målinger, og den første er langt lettere at foretage. Det er i dette mellemrum, de fleste påstande om methylenblåt og hjernen lige siden har befundet sig.
3. Renhed hører til evidensen, ikke til markedsføringen. De historiske kilder er tvetydige af netop denne grund. Små strukturelle forskelle ændrer, hvor forbindelsen ender, og derfor skal et analysecertifikat være knyttet til et bestemt parti frem for blot at blive fremlagt som en erklæring om, at et produkt er testet. En sælger, der hævder overensstemmelse med farmakopémonografien, men kun tester for tungmetaller, påstår mere, end rapporten understøtter. Blupreme køber methylenblåt fra en farmaceutisk producent og tester efter hele den specifikation, monografien angiver: identitet, renhed, organiske urenheder, restopløsningsmidler, elementære urenheder, gløderest, mikrobielle grænser og bakterielle endotoksiner. Rapporten offentliggøres sammen med produktet, og siden om methylenblåt i USP-kvalitet forklarer disse grænser, og hvorfor resultatet for azure B er det første, man bør se efter.

Et dateret kildespor

Den daterede række af milepæle, herunder farvestofkemien før Ehrlich og kvalitetsgraderne og specifikationerne efter ham, er beskrevet særskilt i methylenblåts historie, og selve forbindelsens identitet behandles i hvad methylenblåt er.

De billedplancher, der ligger til grund for denne fremstilling, og som er gengivet i oversigtsartiklen fra 2012 af Krafts, Hempelmann og Skórska-Stania, er ikke ligeværdige, og ét eksempel viser hvorfor. Planchen fra 1891 er den primære dokumentation af forsøget; portrættet fra 1910 ved siden af den tidsfæster et omdømme og intet andet. Sider fra Andersags notesbog fra 1934 er det direkte spor af kinolinsubstitutionen, skrevet med kemikerens egen hånd.

Den ærlige sammenfatning af Ehrlichs farvestofforsøg er, at han havde ret om selektiviteten og målet, men tog fejl af mekanismen. Methylenblåt koncentreres faktisk i nervevæv og skader faktisk malariaparasitten. Det gør ikke det sidste på grund af det første, og den kemiske forklaring, han gav på begge dele, var forkert. Det, han påviste uden for enhver tvivl, var mere varigt end en korrekt mekanisme: en forbindelse kan vælges frem for blot at blive fundet, og den kan vælges på grundlag af evidens indsamlet, før nogen giver den til en patient.