Methylenblåt, tau og amyloid: hvorfor mekanismerne for proteinclearance er forskellige

Spørg, hvad methylenblåt gør ved proteinerne ved Alzheimers sygdom, og du vil høre ét skråsikkert svar, hvor du burde høre tre nuancerede. I et reagensglas forstyrrer det taus binding til sig selv. I én musemodel sænker det opløseligt amyloid uden at påvirke tau. I en anden dæmper det det enzym, der producerer amyloid til at begynde med. Hvert af disse fund er reelt. Ingen af dem fortæller hele historien, og de forekommer ikke alle i det samme dyr på samme tid. Denne artikel adskiller de tre, så et resultat fra ét forsøg ikke længere bliver citeret som bevis for et andet.

Læsere, der ønsker det større overblik over, hvordan methylenblåt virker inde i celler, bør begynde der. Læsere, der vil vide, om noget af dette hjalp patienter, bør læse de kliniske resultater ved Alzheimers sygdom, hvor resultater fra forsøg med mennesker hører hjemme. Denne artikel gentager ikke den gennemgang.

Fundet om tau hører hjemme i aggregeringsassays

Den ældste af de tre historier stammer fra cellefrie forsøg med tau, det protein, der danner neurofibrillære bundter. I tau-tau-bindingsassayet samles fragmenter af tau til parrede helikale filamenter, og phenothiazinfarvestoffer, herunder methylenblåt, blokerer denne samling ved lave mikromolære koncentrationer. Senere biokemisk arbejde gav en kemisk forklaring: Farvestoffet oxiderer cysteinrester på tau, hvilket stabiliserer den monomere form og hæmmer de fibriller, der ellers ville vokse. De rapporterede hæmmende koncentrationer for tauaggregering ligger omtrent fra encifrede til lave tocifrede mikromolære værdier, et interval, der har betydning for alt det følgende.

Bemærk, hvilken type udsagn dette er. Det siger intet om tauproduktion, taufosforylering i en levende hjerne eller tauclearance. Det siger, at oxideret farvestof under definerede forhold i et reagensglas forhindrer tau i at stable sig. Det er et præcist, afgrænset og nyttigt resultat. Problemerne begynder, når det udvides til et generelt udsagn om, at methylenblåt fjerner taupatologi, fordi dyredataene ikke stemmer med den udlægning.

Fundet om proteasomet hører hjemme i 3xTg-AD-mus, og det adskilte amyloid fra tau

Det tydeligste forsøg med forskellige resultater for endepunkterne er et 16-ugers koststudie med mus, der bærer tre Alzheimermutationer. Dyrene spiste foder med methylenblåt fra seksmånedersalderen, og forskerne målte tre ting samtidig: proteasomet, amyloidniveauer og tau.

Proteasomet ændrede sig. Den chymotrypsinlignende aktivitet steg med omtrent en fjerdedel og den trypsinlignende aktivitet med omtrent halvdelen, mens den tredje katalytiske aktivitet ikke ændrede sig signifikant. Opløseligt amyloid-beta 40 og 42 faldt hver med omtrent en fjerdedel. Forfatterne fortolkede dette som øget clearance snarere end reduceret produktion, fordi forstadieproteinet og fragmenterne fra dets processering ikke ændrede sig, og indlæring og hukommelse blev forbedret i vandlabyrintens probeprøve.

Og så var der de resultater, der ikke fulgtes ad. Uopløseligt amyloid ændrede sig ikke. Farvning for plaques ændrede sig ikke. Totalt humant tau og fosfo-tau ved threonin 181 ændrede sig ikke, og fejllokaliseringen af tau ændrede sig heller ikke. De mitokondrielle målinger ændrede sig heller ikke: ingen signifikant effekt på cytokrom-c-oxidaseaktivitet, på oxidaseproteinet eller på ATP. I denne model og med dette behandlingsregime øgede methylenblåt altså to af tre proteasomaktiviteter, sænkede opløseligt amyloid, genoprettede et adfærdsmål og lod tauendepunkter, uopløseligt amyloid og de undersøgte mitokondrielle endepunkter forblive uændrede.

Ét forbehold skærper pointen snarere end at svække den. Disse mus havde endnu ikke udviklet tauaggregater ved den undersøgte alder, så forsøget kan ikke vise, at methylenblåt er uden virkning mod taubundter. Det viser, at opløseligt amyloid kan falde, mens de målte tauendepunkter ikke ændrer sig. Det er netop den slags resultat, hvor ét protein ændrer sig, og et andet ikke gør, som dette emne har brug for. Hvis du kom hertil med den opfattelse, at methylenblåts aktivering af proteasomet fjerner begge karakteristiske proteiner samtidig, er dette studie korrektionen.

Fundet om amyloidproduktion hører hjemme i ældre PSAPP-mus, og det modsiger den tidligere mekanisme

En anden forskergruppe, en anden model og den modsatte forklaring på det forudgående trin. I et tre måneders studie med sondeindgift i 15 måneder gamle PSAPP-mus reducerede en daglig oral dosis på 3 mg/kg plaquebyrden på tværs af hjerneområder med omtrent en tredjedel til halvdelen og sænkede flere amyloidfraktioner, herunder oligomerer målt med et særligt assay. Men her var den foreslåede mekanisme reduceret produktion, ikke hurtigere clearance: BACE1-protein i hjernen faldt, dets produkt C99 faldt, og messenger-RNA gjorde ikke, hvilket peger på en effekt på proteinniveau snarere end lavere genekspression.

Celleforsøgene styrkede forklaringen. I et cellefrit assay med rekombinant enzym hæmmede methylenblåt BACE1 direkte, og i ovarieceller fra hamster, der udtrykker humant amyloidforstadieprotein, faldt udskilt amyloid 40 og 42 ved koncentrationer helt ned til 1.56 mikromolar, mens selve forstadiet forblev uændret. Sammenlign dette med det foregående studie, hvor fragmenterne fra forstadiets processering var uændrede, og clearance fik æren. Begge kan ikke beskrive den samme universelle mekanisme, fordi modeller, aldre, doser, administrationsveje og varigheder er forskellige. Det er pointen. Methylenblåts virkninger på amyloid går gennem produktion i én forsøgsopstilling og gennem clearance i en anden, og det er vildledende at citere nogen af dem uden deres forsøgsopstilling.

Én kemi, flere mål: cysteinoxidation som bindeled

En tredje forskningsretning forklarer, hvordan en enkelt redoxkemi kan optræde i ellers adskilte proteinforløb. I et biokemisk studie af caspasehæmning inaktiverede methylenblåt caspase-6 ved at oxidere dets katalytiske cystein til sulfensyre, bekræftet med massespektrometri, med en koncentration for halvmaksimal hæmning på omkring 10.6 mikromolar. Caspase-3 blev hæmmet ved en lignende koncentration. Forfatterne knyttede dette direkte til taulitteraturen: Den samme cysteinoxiderende kemi, der foreslås at holde tau monomert, kan inaktivere en cysteinprotease, og de virksomme koncentrationer overlapper.

Det er elegant, og det er også en advarsel. Et redoxaktivt molekyle, der oxiderer eksponerede cysteiner, vil have mere end ét mål ved enhver aktiv koncentration. Historien om opløsning af tauaggregater, historien om caspaser og muligvis andre deler et kemisk udsagnsord, men har forskellige navneord. Det fælles udsagnsord gør ikke fundene udskiftelige. Det betyder, at dosis og kontekst afgør, hvilket mål der har betydning, og at langvarig dosering rettet mod én cysteinafhængig proces kan påvirke andre, en overvejelse, som forfatterne til caspasestudiet rejste direkte. Beslægtede spørgsmål om, hvordan methylenblåts redoxkemi udvælger sine mål, hvad proteasomaktivering indebærer for andre aggregerede proteiner, og om langvarig dosering ændrer målprofilen, fortjener hver sin behandling.

Mekanisme efter endepunkt: hvilket fund hører til hvilken model

Læs tabellen række for række, og læren er tydelig. Ingen enkelt række ændrer sig i alle kolonner. Det stærkeste resultat om amyloidproduktion kommer fra det studie, der aldrig undersøgte proteasomet. Det stærkeste resultat om proteasomet kommer fra det studie, hvor forstadiets processering aldrig ændrede sig. Resultatet om tau findes hovedsageligt i reagensglas og i kemi, som deles med enzymer uden for det tilsigtede mål. Enhver, der slår disse kolonner sammen til ét udsagn om, at methylenblåt fjerner patologiske proteiner som en samlet klasse, skriver en oversigt over et forsøg, der aldrig blev udført.

Denne disciplin gælder også patienter. Om disse mekanismer samlet fører til klinisk gavn, er et særskilt spørgsmål med sine egne forsøg og konklusioner, og det besvares under den kliniske evidens ved Alzheimers sygdom snarere end her.