Methylenblåts opløselighed i vand og fremstilling af opløsninger fra pulver

To teknikere fremstiller hver en 1 procent methylenblåtopløsning fra pulver. Den ene afvejer 1.00 gram og fylder kolben op til 100 mL. Den anden afvejer 1.00 gram, tilsætter det til 100 mL vand og betragter arbejdet som færdigt. En tredje tekniker afvejer 1.00 gram fra et andet parti og får en målbart anderledes koncentration. Alle tre flasker er mærket ens. Ingen af dem indeholder helt det, etiketten angiver, og forskellene skyldes tre begreber, som er lette at forveksle: hvor meget opløsningsmidlet kan opløse, hvad det afvejede pulver faktisk er, og hvad procenten henviser til.

Denne vejledning handler kun om formulering i laboratoriet: farvningsopløsninger, indikatorer, analytiske stamopløsninger og arbejdsfortyndinger. Den er ikke en opskrift på medicin til oral brug eller injektion, og koncentrationerne her skal ikke opfattes som doser.

Hvad opløseligheden bestemmer, og hvad den ikke bestemmer

Methylenblåts opløselighed i vand er høj for et farvestof. PubChems stofpost for methylenblåt angiver omkring 43.6 gram pr. liter ved 25 C, hvilket svarer til 4.36 gram pr. 100 mL eller 4.36 procent w/v. En uafhængig ligevægtsundersøgelse ved samme temperatur målte 43.21 g/L og bekræftede den ældre værdi inden for forsøgsusikkerheden.

Dette tal er en øvre grænse, ikke et mål. En 1 procent stamopløsning er 10 g/L, mindre end en fjerdedel af grænsen. En 0.1 procent stamopløsning er 1 g/L, omtrent en fyrretyvendedel af den. Hvis en 1 procent opløsning stadig indeholder faste partikler efter grundig blanding ved stuetemperatur, er problemet næsten aldrig opløselighedsgrænsen. Det skyldes som regel ufuldstændig befugtning, koldt vand, pulverklumper, der kræver mere tid, eller et opløst stof, som er blevet fejlidentificeret. Varmt vand og omrøring løser de fleste af disse problemer. Hvis der er anvendt opvarmning, skal kolben vende tilbage til sin kalibreringstemperatur, før der fyldes op til slutvolumen.

Opløseligheden i andre opløsningsmidler er lavere og varierer mere mellem kilderne, blandt andet fordi det undersøgte materiales hydratform er forskellig. Vand er fortsat referenceopløsningsmidlet til rutinemæssige stamopløsninger i laboratoriet. Ethanol opløser farvestoffet, men kan opløse væsentligt mindre end vand; chloroform opløser det også, pyridin kun i begrænset omfang, og diethylether stort set slet ikke. Acetone og ethylacetat ligger langt under vand i måleserier. Ved arbejde med ikke-vandige opløsninger bør ethvert håndbogstal behandles som et indledende skøn og verificeres med det konkrete parti, ikke som en formuleringsgrænse. Den praktiske pointe er enkel: Hvis målet er en veldefineret vandig koncentration på eller under 1 procent, giver vand en stor margin.

Pulveret er ikke én bestemt ting

Methylenblåtpulver, der sælges til laboratoriebrug, er et chloridsalt med vand i krystalgitteret, og mængden af dette vand varierer. Den vandfri ion har en molarmasse på 319.85 g/mol. Det ofte nævnte trihydrat har en molarmasse på 373.90 g/mol, og pentahydratet har en molarmasse på 409.93 g/mol; disse værdier er opført i USP-monografidataene, som er sammenfattet sammen med PubChem-posten.

Kommercielle flasker er ofte mærket trihydrat, CAS 7220-79-3, men faststofundersøgelser har vist, at det faktiske materiale kan være et pentahydrat, et delvist hydrat med omkring 2.2 vandmolekyler, et dihydrat eller et monohydrat, og at nogle analyser ikke finder nogen særskilt krystallinsk trihydratfase. Farvestoffet er også hygroskopisk, så vandindholdet i en åbnet flaske ændrer sig med tiden. Ved kvalitativ farvning har dette næsten ingen betydning. Ved kvantitativt analytisk arbejde har det stor betydning, og derfor betragter vejledningen i at læse indholdsbestemmelse og vandindhold på et analysecertifikat partidokumentationen som mere autoritativ end ordet trihydrat på etiketten.

Dette giver to mulige korrektionsmetoder, og kun én bør bruges ad gangen. Hvis certifikatet angiver indholdsbestemmelse og vandindhold eller tørringstab, bruges disse tal direkte. Hvis der ikke findes certifikatdata, og koncentrationen skal udtrykkes som vandfri ækvivalent, anvendes den teoretiske hydratfaktor: 373.90 divideret med 319.85, eller 1.169, for nominelt trihydrat og 409.93 divideret med 319.85, eller 1.282, for nominelt pentahydrat. Anvend ikke begge korrektioner samtidig. Så medregnes vandet to gange.

Hvad procent betyder

Procent w/v betyder gram af det specificerede opløste stof pr. 100 mL færdig opløsning, ikke pr. 100 mL vand ved fremstillingens start. Dermed er 1 procent w/v 1.000 g pr. 100 mL slutvolumen, svarende til 10 mg/mL eller 10 g/L. En 0.1 procent opløsning er 0.100 g pr. 100 mL slutvolumen, svarende til 1 mg/mL. Den almindelige forveksling af 1 procent med 1 mg/mL er en fejl med en faktor ti, og det er værd at kontrollere alle etiketter for den.

Den anden halvdel af definitionen er specifikationen af det opløste stof. En 1 procent opløsning baseret på trihydratpulverets afvejede masse og en 1 procent opløsning udtrykt som vandfri ækvivalent er forskellige opløsninger. De gennemregnede eksempler nedenfor angiver hver gang både slutvolumen og beregningsgrundlaget; denne vane forebygger problemet med de tre teknikere ovenfor.

Gennemregnede fremstillinger med angivne hydratforudsætninger

Alle eksempler forudsætter rent pulver af det angivne hydrat og vand som opløsningsmiddel ved stuetemperatur. Skalér lineært ved andre volumener.

Eksempel A: 100.0 mL med 1 procent w/v, baseret på trihydratets afvejede masse. Afvej 1.000 g methylenblåttrihydrat. Tilsæt omkring 70 mL renset vand, omrør eller sving rundt, indtil alt er opløst, overfør kvantitativt til en 100.0 mL målekolbe med skylninger, og tilsæt derefter vand til mærket. Det opløste stof er selve trihydratet, så der anvendes ingen korrektion for molarmasse. Resultat: 1.000 g pr. 100.0 mL slutvolumen eller 10 mg/mL afvejet pulver.

Eksempel B: 100.0 mL med 1 mg/mL, udtrykt som vandfri ækvivalent, fra nominelt trihydrat. Målet er 100.0 mg vandfrit methylenblåt i 100.0 mL slutvolumen. Gang med 1.169 for at korrigere for de tre vandmolekyler: 100.0 mg gange 1.169 er lig med 116.9 mg. Afvej 116.9 mg nominelt trihydrat, opløs det i omkring 70 mL vand, og fyld op til 100.0 mL slutvolumen i en målekolbe. For nominelt pentahydrat er faktoren 1.282, så det samme mål kræver 128.2 mg. Angiv på etiketten, hvilken faktor der blev brugt.

Eksempel C: fortynding af methylenblåt fra en 1 procent stamopløsning til 0.1 procent. Brug C1V1 lig med C2V2. For at fremstille 100.0 mL med 0.1 procent fra en 1.0 procent stamopløsning er det nødvendige volumen stamopløsning 0.1 gange 100.0 divideret med 1.0, hvilket er 10.0 mL. Pipettér 10.0 mL af 1 procent stamopløsningen over i en 100.0 mL kolbe, og tilsæt vand til mærket. For analytikere, der foretrækker masseenheder: 1 procent er 10 mg/mL, så 10.0 mL indeholder 100 mg, og 100 mg i 100.0 mL slutvolumen er 1 mg/mL, hvilket er 0.1 procent.

Eksempel D: 1.000 L arbejdsopløsning med 10 mg/L fra en 1 mg/mL stamopløsning. En 1 mg/mL stamopløsning er 1000 mg/L. Det nødvendige volumen er 10 gange 1.000 divideret med 1000, hvilket er 0.0100 L eller 10.0 mL. Pipettér 10.0 mL stamopløsning, og fortynd med vand til 1.000 L slutvolumen. Fra en 1 procent stamopløsning med 10,000 mg/L kræver det samme mål kun 1.00 mL, der fortyndes til 1.000 L. Seriefortynding i to trin giver bedre nøjagtighed end en enkelt overførsel på mikroliterniveau, når forholdet overstiger omkring hundrede.

Hvert af disse eksempler er kun en fuldstændig specifikation, fordi det indeholder tre oplysninger: den afvejede masse med den tilhørende hydratforudsætning, opløsningens slutvolumen og grundlaget for den angivne koncentration. En notering i laboratoriejournalen, som mangler en af de tre, kan ikke reproduceres præcist.

En fremgangsmåde, der undgår de sædvanlige fejl

Opløs først pulveret i et mindre volumen end slutvolumen, og fyld derefter op til det ønskede volumen. Hvis pulveret tilsættes direkte til hele det tilsigtede slutvolumen vand, bliver opløsningens samlede volumen større end det tilsigtede, og koncentrationen bliver for lav. Skyl bægerglasset over i kolben, så der ikke bliver farve tilbage; den intense farve gør små tab synlige, hvilket er en fordel, hvis det tilskynder til kvantitativ overførsel.

Bland, indtil der ikke er partikler tilbage, før der fyldes op til slutvolumen, og kontrollér opløsningen mod lyset. Filtrér kun, når metoden kræver det. Methylenblåt adsorberes til visse membranmaterialer, så filtrering kan sænke koncentrationen af en stamopløsning, der netop er blevet standardiseret. Dette er dokumenteret i undersøgelser af membranadsorption og er værd at huske, når filtrering eller kontrol af koncentrationen indgår i metoden. Hvis en filtreret stamopløsning skal have en certificeret koncentration, skal koncentrationen verificeres efter filtrering, ikke før.

Opbevar fremstillede opløsninger beskyttet mod stærkt lys i brune eller uigennemsigtige flasker ved stuetemperatur, og mærk dem med opløst stof, hydratgrundlag, koncentration, opløsningsmiddel, dato og den person, der har fremstillet dem. Fotoblegning ved vedvarende belysning er en kendt nedbrydningsvej, så vindueskarme og oplyste køleskabe er dårlige opbevaringssteder, selv om farvestoffet ser stabilt ud. Forventninger til stabilitet og intervaller for gentest hører hjemme i vejledningen om opbevaring og stabilitet af fremstillede opløsninger, men som praktisk regel bør analytiske stamopløsninger fremstilles på ny eller verificeres igen frem for at blive betragtet som pålidelige på ubestemt tid.

Håndtér pulveret og koncentrerede stamopløsninger med handsker, øjenbeskyttelse, laboratoriekittel og afdækning af arbejdsbordet samt sekundær opsamling til flaskerne. Farvestoffet farver hurtigt hud, tøj, arbejdsborde og plast, og leverandørernes sikkerhedsdatablade klassificerer pulveret som sundhedsskadeligt ved indtagelse og irriterende for øjne og hud afhængigt af kvaliteten. De fulde forholdsregler hører hjemme i vejledningen om sikker håndtering og opbevaring, men kontrol med farvestofpletter er i sig selv en kvalitetsforanstaltning: utilsigtet farvestof på glasudstyr og pipetter er en kilde til krydskontaminering ved sporanalyse.

En bemærkning om kvalitet

Til farvebade og demonstrationer er enhver ren laboratoriekvalitet, fremstillet med den rette koncentration, anvendelig. Ved kvantitativt eller sammenlignende arbejde har kvaliteten betydning, fordi urenhederne varierer: rester af Azure B og beslægtede thiaziner, tungmetaller, rester af opløsningsmidler og mikrobiel belastning. Derfor er valg af en kvalitet understøttet af et fuldstændigt analysecertifikat en del af formuleringen og ikke noget, der først overvejes bagefter. En fuldstændig partidokumentation angiver identitet, indholdsbestemmelse med dens beregningsgrundlag, vandindhold og de urenheder, der faktisk er undersøgt for, så hydratkorrektionen i eksemplerne ovenfor bruger målte værdier i stedet for antagelsen om nominelt trihydrat. Når to partier giver forskellige koncentrationer med samme afvejede masse, forklarer certifikatet som regel hvorfor.