Kan methylenblåt omgå mitokondrielt kompleks III? Hvorfor studierne er uenige

To laboratorier undersøgte, om methylenblåt kan omgå et blokeret mitokondrielt kompleks III. Det ene svarede nej. Det andet svarede ja. Begge havde data.

Det første studie, med mitokondrier fra musehjerner, fandt, at farvestoffet ikke kan. Det andet, med hjernemitokondrier fra tre gnaverarter, fandt, at det delvist kan. Et tredje studie, med muselever, citeres ofte i samme sammenhæng, men undersøgte noget andet. Hold det adskilt, og halvdelen af forvirringen forsvinder.

Der er ingen universel mekanisme at fremlægge. Der er tre forsøg med forskellige hæmmere, doser og måleparametre. Læs først forsøgsbetingelserne. Konklusionerne følger deraf.

Hvad omgåelse betyder her

Elektroner kommer ind i kæden gennem kompleks I (fra NADH) eller kompleks II (fra succinat), passerer gennem kompleks III til cytokrom c og derefter gennem kompleks IV til ilt. Den gradient, der opbygges undervejs, er det, cellen bruger til at danne ATP.

En påstand om omgåelse indebærer, at methylenblåt optager elektroner før en blokering og afleverer dem efter den. Det oxiderede farvestof optager elektroner fra NADH eller tidlige komponenter i kæden og bliver til leukomethylenblåt, mens den reducerede form afleverer dem til cytokrom c eller tilbage til kæden. Hvis overførslen sker efter blokeringen, genoprettes respirationen og membranpotentialet delvist. Hvis den sker ved eller før blokeringen, genoprettes ingen af delene.

Én detalje ved kompleks III er afgørende for en stor del af denne uenighed. Komplekset driver en Q-cyklus med to bindingssteder for hæmmere. Antimycin binder til Qi-stedet. Myxothiazol binder til Qo-stedet. Et studie, der kun bruger den ene af dem, har kun undersøgt halvdelen af komplekset.

Studie et: Ingen omgåelse i mitokondrier fra musehjerner

Gureev og kolleger brugte mitokondrier fra hjernebarken hos C57BL/6-mus, isoleret med digitonin og undersøgt ved 0.1 mg protein pr. ml. Substraterne dækkede tre betingelser: pyruvat plus malat ved 5 mM hver, succinat ved 10 mM med glutamat ved 2 mM og L-prolin ved 10 mM. Hæmmerne var rotenon ved 1 micromolar (kompleks I) og antimycin ved 1 microgram pr. ml (kompleks III). Farvestofdoserne var 0.5, 1 og 2 micromolar, med 1 micromolar som den primære koncentration. Metoder og målekurver findes i artiklen i FEBS Letters.

Omgåelse af kompleks I virkede. Rotenon sænkede den ADP-stimulerede respiration fra omkring 121 til omkring 2 nmol pr. minut pr. mg, og 1 micromolar farvestof øgede den igen til omkring 21. Membranpotentialet blev genoprettet med pyruvat plus malat og med L-prolin.

Omgåelse af kompleks III virkede ikke. Antimycin sænkede respirationen til omkring 16, og farvestoffet øgede den kun til omkring 20. Membranpotentialet blev ikke genoprettet med noget substrat ved farvestofdoser op til 5 micromolar. Peroxiddata pegede i samme retning: Farvestoffet alene øgede peroxidfrigivelsen fra en basal hastighed på omkring 76 pmol pr. minut pr. mg til cirka 1170, 1460 og 1945 ved de tre doser, men antimycin reducerede dette farvestofdrevne signal med henholdsvis omkring 25, 88 og 96 procent. Hvis det reducerede farvestof reagerede direkte med ilt, burde blokering af kompleks III ikke undertrykke signalet. Forfatterne udledte, at det reducerede farvestof oxideres ved Qo-stedet i kompleks III, før antimycinblokeringen. Det korte kredsløb med ord: donorer til farvestof, farvestof til Qo, derefter videre ad den normale vej. Rotenon omgås. Antimycin gør ikke.

Studie to: Delvis omgåelse i tre arter ved begge hæmmerbindingssteder

Svab og kolleger udvidede forsøgsdesignet. Hjernemitokondrier fra mus, rotter og marsvin, isoleret med Percoll, blev undersøgt ved samme koncentration på 0.1 mg pr. ml med pyruvat plus malat eller glutamat plus malat ved 5 mM hver. De brugte to hæmmere af kompleks III: antimycin A ved 0.3 micromolar og myxothiazol ved 1 micromolar. Farvestofkoncentrationen var 2 micromolar i de fleste analyser og 0.5 i forsøgene med cytokrom c. Alle tre arter med ensartede protokoller er beskrevet i artiklen med åben adgang.

Begge blokeringer blev delvist omgået i alle tre arter. I musemitokondrier hæmmede antimycin respirationen, og farvestoffet øgede den med omkring 60 procent, fra cirka 37 til 59 nmol pr. minut pr. mg. Myxothiazol hæmmede den med 88 procent til omkring 4.5, og farvestoffet øgede den femfold til omkring 23. Membranpotentialet blev delvist genoprettet ved begge hæmmere, målt med to farvestoffer (safranin O og ratiometrisk TMRM) for at udelukke optiske artefakter.

Dette studie undersøgte også elektronoverførslen direkte, hvilket det første studie aldrig gjorde. Eksogent acetyleret cytokrom c ved 25 micromolar blev ikke reduceret af energiserede mitokondrier, hverken med eller uden hæmmere, men tilsætning af farvestoffet drev reduktionen i begge tilfælde. I cellefri buffer reducerede NADH plus farvestof cytokrom c med en hastighed, der var proportional med NADH. Det længere spring med ord: reduktionsækvivalenter til farvestof, farvestof direkte til cytokrom c, kompleks IV til ilt. Denne vej springer kompleks III helt over, så begge hæmmere kan omgås.

To yderligere måleparametre understøtter den fortolkning. NAD(P)H-fluorescensen faldt, når farvestoffet blev tilsat mitokondrier behandlet med myxothiazol, hvilket betyder, at reduktionsækvivalenter blev ledt gennem den nye vej. Og farvestoffets absorbans ved 660 nm fulgte hver tilsætning, mens centrifugerede supernatanter viste, at oxideret farvestof blev opkoncentreret mere end hundrede gange inde i energiserede mitokondrier og derefter forlod dem, når potentialet kollapsede. Protonregnskabet stemmer også: Når pumpetrinnene springes over, er der cirka 2 protoner pr. elektronpar i stedet for 10, så hurtigere iltforbrug med kun delvis genoprettelse af membranpotentialet er netop, hvad en reel omgåelse ser ud som, ikke et argument imod den.

Det samme præparat gav responser, som let kan misforstås ved overfladisk læsning. Med hæmmer plus farvestof sænkede ADP respirationen i stedet for at øge den, og transportblokering stimulerede den i stedet for at sænke den, mens membranpotentialet stadig ændrede sig i de normale retninger. Iltforbrug alene er misvisende i dette system.

Studie tre: Leverstudiet, der undersøgte kompleks I og II, ikke III

Lee og Boelsterli brugte mitokondrier fra muselever og dyrkede hepatocytter beskadiget af efavirenz (kompleks I, IC50 omkring 30 micromolar) og hydrazin, isoniazids metabolit (kompleks II, IC50 omkring 30 micromolar). Farvestof ved omkring 30 micromolar genoprettede NADH-oxidation, membranpotentiale og ATP, samtidig med at det reducerede oxidanter og nekrotisk celledød. Artiklen i Redox Biology beskriver i sin model, at farvestoffet transporterer elektroner uden om de beskadigede komplekser I og II.

Det resultat er afklaret baggrundsviden om de tidligere trin i kæden, og det siger intet om kompleks III, fordi intet blev blokeret dér. Det kan hverken bekræfte eller afkræfte nogen af hjernestudierne.

Matricen over forsøgsbetingelser

Fire grunde til, at begge studier af kompleks III kan have ret om deres egne forsøgsopstillinger

1. Hæmmerne udgjorde ikke samme indgreb. Antimycin alene ved 1 microgram pr. ml over for antimycin ved 0.3 micromolar plus en separat hæmmer af Qo-stedet. En farvestofvej, der leder elektroner til Qo-stedet, svigter præcis dér, hvor en vej direkte til cytokrom c lykkes. Ét sted kan ikke repræsentere begge.

2. Farvestofdosis og tidsforløb var forskellige. Primære koncentrationer på 1 over for 2 micromolar for et stof, der indgår i redoxcyklusser, og hvis optagelse og direkte reduktion af cytokrom c afhænger af koncentration og tid. Små dosisforskelle kombineret med forskellige måletidspunkter kan afdække forskellige grene af det samme netværk.

3. Præparaterne var forskellige. Isolering med digitonin over for isolering i en Percoll-gradient udvælger overlappende, men ikke identiske mitokondriepopulationer. Proteinkoncentrationen var ens ved 0.1 mg pr. ml, så den variabel kan udelukkes, men det kan delpopulation og integritet ikke. Og art blev afkræftet som forklaring: Den anden gruppe reproducerede også sin fænotype i mus.

4. Substratbetingelserne afgør, hvad farvestoffet kan gøre. Tre substratbetingelser over for NADH-koblede par. NADH-tilførsel og membranpotentiale bestemmer tilsammen, hvor hurtigt farvestoffet reduceres, og hvordan det fordeler sig, og en vej, der kræver reduceret farvestof ved siden af oxideret cytokrom c, afhænger helt af det valg.

Sådan læser du den næste påstand om omgåelse

Spørg, hvilket kompleks der blev blokeret, med hvilken hæmmer, ved hvilket sted og hvilken dosis. Spørg til farvestofkoncentrationen, og hvornår målingen blev foretaget. Spørg til væv, art, isolering, proteinkoncentration og substrat. Og spørg, om potentiale, respiration, redoxtilstand og en direkte analyse af elektronoverførsel stemmer overens, for iltforbrug alene pegede mere end én gang i den forkerte retning her.

Den snævre opsummering holder. Der er enighed om farvestoffets omgåelse af kompleks I. For kompleks III viser musemitokondrier med antimycin ved 1 microgram pr. ml og farvestof ved 1 micromolar ingen funktionel omgåelse, mens tre arter med antimycin ved 0.3 micromolar eller myxothiazol ved 1 micromolar og farvestof ved 2 micromolar viser delvis omgåelse med direkte overførsel fra farvestof til cytokrom c. De udsagn kan godt eksistere side om side. Alt derudover er ekstrapolation.

Relateret læsning holder den omstridte påstand inden for den uomstridte kemi: hvordan methylenblåt flytter elektroner om elektronrelæet, forsøgene med omgåelse af kompleks I om det afklarede tilfælde tidligere i kæden, målinger af membranpotentiale og deres artefakter om, hvorfor der var brug for to farvestoffer, og laboratoriehåndtering af stoffer, der indgår i redoxcyklusser, om faldgruberne ved dosering og timing.